ICS 07. 100.30 C 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19915.1—2005 猪链球菌2型平板和试管凝集 试验操作规程 Procedure of plate and tube agglutination for Streptococcus suis type 2 2005-09-27发布 2005-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19915.1—2005 前言 猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。人可通 过伤口感染该菌，并导致发病和死亡。为了通过检测猪血清中猪链球菌2型的抗体，进行猪链球菌2型 病的检测和监测，特制定本标准 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准由中华人民共和国江苏出人境检验检疫局和中国检验检疫科学院负责起草。 本标准主要起草人：陈国强、张敬友、张常印、唐泰山、姜焱、王凯民、林祥梅、韩雪清、吴绍强、刘建、 贾广乐、梅琳。 本标准为首次发布。 GB/T 19915.1—2005 猪链球菌2型平板和试管凝集 试验操作规程 1范围 本标准规定了猪链球菌2型平板和试管凝集试验的操作技术要求。 本标准适用于猪及其他各种家畜猪链球菌2型抗体的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法 3试剂和材料 3.1试剂 3.1.1标准抗原：由指定单位提供，按说明书使用，使用时须回至室温，并充分摇匀。 3.1.2标准阳性血清：由指定单位提供，按说明书使用，使用时须回至室温，并充分摇匀。 3.1.3标准阴性血清：由指定单位提供，按说明书使用，使用时须回至室温，并充分摇匀。 3.1.4试验用蒸馏水：GB/T6682—1992中的三级水。 3.1.5稀释液：0.5%石炭酸生理盐水（含0.5%石炭酸、0.85%NaCI）。 3.2材料 3.2.1玻璃板：要求洁净，划成每格3cm×3cm的区域，每一格下留少许位置，用于填写血清号。 3.2.2移液器和（或）可调连续加样器及配套的移液器枪头。 3.2.3试管架和试管：规格为13mmX100mm，圆底，洁净。 3.2.4被检血清：按常规方法采血分离血清，血清必须新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血，无腐败气味。 运送和保存血清样品时，应防止血清冻结和受热，以免影响凝集价。若3天内不能送到实验室，可 用冷藏方法运送血清。试验时须回至室温。 4操作方法 4.1平板凝集试验 4.1.1将玻璃板上各格标上阳性血清、阴性血清和被检血清号，每格各加25uL平板凝集抗原 4.1.2在各格凝集抗原旁分别加入阳性血清、阴性血清和相应的被检血清25μL。 4.1.3用牙签或移液器枪头搅动被检血清和抗原使之均匀混合，形成直径约2cm的液区。轻微摇动， 室温下于4 min内观察结果。 4.2试管凝集试验 4.2.1稀释被检血清 4.2.1.2取被检血清0.5mL，加人第1管，充分混匀，从第1管中吸取0.5mL加人到第2管，混合均 匀后，再从第2管吸取0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第6管，从第6管弃去0.5mL，稀释完毕。 1 GB/T19915.1—2005 4.2.2加抗原 将0.5mL抗原加人已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，血清稀释度则依次变为1：4、1：8、 1：16、1：32、1：64、1：128。各反应管反应总量为1mL。 4.2.3设立对照 每次试验都应设立下列对照 4.2.3.1阴性血清对照 阴性血清的稀释和加抗原的方法与被检血清同。 4.2. 3. 2阳性血清对照 阳性血清的最高稀释度应超过其效价滴度，加抗原的方法与被检血清同。 4.2.3.3抗原对照 在0.5mL稀释液中,加0.5mL抗原。 4.2.4配制比浊管 每次试验均须配制比浊管，作为判定凝集反应程度的依据，先将抗原用等量稀释液作一倍稀释，然 后按下表配制比浊管。 表1# 比浊管的配制 试管号 2 3 4 5 抗原稀释液 1. 00 0.75 0.50 0.25 0 0.5%石炭酸生理盐水 0 0.25 0.50 0.75 1.00 清亮度/（%） 0 25 50 75 100 凝集度标记 + ++ +++ ++++ 注：“+++十”表示完全凝集，菌体100%下沉，上层液体100%清亮； “+++"表示几乎完全凝集，上层液体75%清亮； “十+”表示凝集很显著，液体50%清亮； “+”表示有沉淀，液体25%清亮； “二”表示无沉淀，液体不清亮。 4.2.5感作 所有试验管充分振荡后，置37℃温箱感作20h。 5判定 5.1平板凝集试验结果判定 当阴性血清对照不出现凝集（一），阳性血清对照出现凝集（十）时，则试验成立，可以判定。否则应 重做。 在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（十），不出现凝集者判为阴性（一）。出现阳性反应 的样品，可经试管凝集试验定量测定其效价。 5.2试管凝集试验结果判定 5.2.1试验成立条件 当阴性血清对照和抗原对照不出现凝集（一），阳性血清的凝集价达到其标准效价士1个滴度，则证 明试验成立，可以判定。否则，试验应重做。 5.2.2确定每份被检血清效价 比照比浊管判读，出现十十以上凝集现象的最高血清稀释度为血清凝集价。 待检血清最终稀释度1：4并出现“十十”以上的凝集现象时，判为阳性反应。 2 GB/T19915.1—2005 4.2.2加抗原 将0.5mL抗原加人已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，血清稀释度则依次变为1：4、1：8、 1：16、1：32、1：64、1：128。各反应管反应总量为1mL。 4.2.3设立对照 每次试验都应设立下列对照 4.2.3.1阴性血清对照 阴性血清的稀释和加抗原的方法与被检血清同。 4.2. 3. 2阳性血清对照 阳性血清的最高稀释度应超过其效价滴度，加抗原的方法与被检血清同。 4.2.3.3抗原对照 在0.5mL稀释液中,加0.5mL抗原。 4.2.4配制比浊管 每次试验均须配制比浊管，作为判定凝集反应程度的依据，先将抗原用等量稀释液作一倍稀释，然 后按下表配制比浊管。 表1# 比浊管的配制 试管号 2 3 4 5 抗原稀释液 1. 00 0.75 0.50 0.25 0 0.5%石炭酸生理盐水 0 0.25 0.50 0.75 1.00 清亮度/（%） 0 25 50 75 100 凝集度标记 + ++ +++ ++++ 注：“+++十”表示完全凝集，菌体100%下沉，上层液体100%清亮； “+++"表示几乎完全凝集，上层液体75%清亮； “十+”表示凝集很显著，液体50%清亮； “+”表示有沉淀，液体25%清亮； “二”表示无沉淀，液体不清亮。 4.2.5感作 所有试验管充分振荡后，置37℃温箱感作20h。 5判定 5.1平板凝集试验结果判定 当阴性血清对照不出现凝集（一），阳性血清对照出现凝集（十）时，则试验成立，可以判定。否则应 重做。 在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（十），不出现凝集者判为阴性（一）。出现阳性反应 的样品，可经试管凝集试验定量测定其效价。 5.2试管凝集试验结果判定 5.2.1试验成立条件 当阴性血清对照和抗原对照不出现凝集（一），阳性血清的凝集价达到其标准效价士1个滴度，则证 明试验成立，可以判定。否则，试验应重做。 5.2.2确定每份被检血清效价 比照比浊管判读，出现十十以上凝集现象的最高血清稀释度为血清凝集价。 待检血清最终稀释度1：4并出现“十十”以上的凝集现象时，判为阳性反应。 2