ICS 07.100.30 C 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19915.5—2005 猪链球菌2型多重PCR检测方法 Protocol of multiplex PCR identification of Streptococcus suis type 2 2005-09-27发布 2005-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19915.5—2005 前言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准由中国检验检疫科学研究院负责起草。 本标准主要起草人：韩雪清、林祥梅、吴绍强、刘建、贾广乐、梅琳、陈国强、张敬友、姜焱、唐泰山。 本标准为首次发布， GB/T19915.5—2005 猪链球菌2型多重PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪链球菌2型多重PCR检测的操作方法 本标准适用于检测生猪拭子、增菌培养物、疑似病料及猪组织样品（猪淋巴结、扁桃体、肉品等）中的 猪源链球菌及猪链球菌2型。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法。 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 猪链球菌2型Streptococcussuistype2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1～34及1/2共35个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是 一种重要的人畜共患病病原菌。 3. 2 多重聚合酶链式反应（多重PCR）multiplexpolymerasechainreaction 多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系中加上两对以上引物，同时 扩增出多个核酸片断的PCR反应。 4缩略语 本标准采用下列缩略语： PCR 聚合酶链式反应 DNA 脱氧核糖核酸 dNTP 脱氧核酸三磷酸 bp 碱基对 5试剂和材料 除另有规定外.所用生化试剂均为分析纯.水为符合GB/T6682一1992的灭菌双蒸水或超纯水 5.1猪链球菌2型多重PCR反应混合物 PCR缓冲液（含Mg2+），2μL；dNTP,1.6μL，引物1,0.6μL；引物2,0.6μL；引物30.6μL引物 4,0.6μL；菌液1.5μL；酶0.2μL；水12.3μL；总体积20μ。 5.2TaqDNA聚合酶 5.310XPCR缓冲液 100mmol/LKCl,160mmol/L（NH2?SO4,20mmol/LMgSO4,200mmol/LTris-HCl GB/T19915.5—2005 (pH8.8),1% Triton X-100,1mg/mL BSA。 5.4dNTP混合液（各2.5mmol/L） 5.5琼脂糖：电泳级 5.6溴化乙锭 5.7DNA分子量标准 5.8TE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl(pH8. 0),1 mmol/L EDTA。 5.9核酸电泳缓冲液 Tris碱242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA100mL，加蒸馏水至1000mL，使用时10倍 稀释。 5.10电泳加样缓冲液 0.25%漠酚蓝，40%蔗糖 5.11样品对照 猪链球菌2型菌DNA提取物分别作为阳性对照，马链球菌兽疫亚种DNA提取物为阴性对照。 6仪器和设备 6.1 台式冷冻高速离心机（>13000r/min）。 6.2DNA热循环仪。 6.3核酸电泳仪和水平电泳槽。 6.4 凝胶成像系统（或紫外透射仪）。 6.5可调移液器一套：10μL20μL、200μL和1000μL。 6.6恒温水浴箱。 7操作方法 7.1方法概要 取培养菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板，加人到扩增猪链球菌和猪链球菌2型的 PCR反应混合液中，进行PCR扩增；或直接将待检细菌培养进行PCR扩增。最后通过琼脂糖凝胶电 泳检测PCR产物，与DNA标准分子量进行比较，来确定扩增产物的大小，在此基础上判定样品的检测 结果。 7.2样品采集 在实验室生物安全柜中操作，将采集的组织样本剔除包膜和其他结缔组织，选取内部实质部分，冻 存于一20℃备用。 7.3组织样本DNA的制备 采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，按说明书进行操作。 7.4多重PCR扩增 将培养的细菌纯培养物样品（不经过离心）1.2μL、或者将制备的各样品DNA以及阳性和阴性对 照DNA各1.5uL分别加人到含有猪链球菌2型菌的PCR反应混合液的相应PCR反应管中[缓冲液 (含Mg2+),2μL;dNTP,1.6μL引物1,0.6μL;引物2,0.6μL;引物3,0.6μL;引物4,0.6μL;酶 0.2μL;加水至总体积20μL],2000r/min离心10s,加人Taq酶（5U/μL)0.2μL,2000r/min离心 1OS，采用DNA热循环仪立即进行PCR扩增。 PCR扩增条件：94℃7min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，40个循环；72℃10min。扩增反应结 2 GB/T19915.5—2005 束后，取出放置于4℃。 7.5多重PCR扩增产物的电泳检测 称取2.0g琼脂糖加入100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化后加人适量的溴化乙锭 (0.5μg/mL），然后制成凝胶板。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5μL～10μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。9V/cm恒压下电泳30min~ 35min。将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录。 8结果判定 8.1 试验结果成立条件 猪链球菌2型阳性对照的PCR产物，经电泳后在305bp和460bp位置同时出现特异性条带，同时 阴性对照PCR产物电泳后没有任何条带，则检测试验结果成立，否则结果不成立。 8.2阳性判定 在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在305bp和460bp的位置上同时出现特 异性条带，判定为猪链球菌2型检测阳性；若305bp位置出现特异条带而460bp位置无特异条带，判 定为猪源链球菌阳性，但不是2型菌。 8.3阴性判定 如果在305bp和460bp的位置上均未出现特异性条带，判定为猪链球菌检测阴性。