ICS 07. 100.30 C 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 19915.9—2005 猪链球菌 2型溶血素基因PCR 检测方法 Detection method of the hemolysin gene for Streptococcus suis type 2 by PCR 2005-09-27发布 2005-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 19915.9—2005 前言 猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。近年来， 随着我国养猪业的发展，该病流行日趋严重，给养猪业带来巨大损失。人可通过伤口感染该菌，并导致 死亡。溶血素是猪链球菌2型一种重要毒力因子。通过检测猪及其产品中分离菌株是否含有猪链球菌 2型溶血素基因，可以作为区分猪链球菌2型无毒菌株与致病菌株的一个指标，特制定本标准。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：陈国强、唐泰山、张敬友、姜焱、王凯民、张常印、林祥梅、吴绍强、刘建、韩雪清、 贾广乐、梅琳。 GB/T19915.9—2005 猪链球菌2型溶血素基因PCR 检测方法 1范围 本标准规定了猪链球菌2型溶血素基因PCR检测的操作方法。 本标准适用于猪及其产品中分离菌株的猪链球菌2型溶血素基因的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 猪链球菌2型Streptococcussuistype2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1～34及1/2共35个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是 一种重要的人畜共患病病原菌。 4缩略语 PCR polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 DNA deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸 dNTP deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸 bp basepair，碱基对 5测定方法 5.1方法提要 标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。 5.2试剂和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682一1992的灭菌双蒸水。 5.2.1猪链球菌2型溶血素基因PCR反应混合物：10×PCR缓冲液2.5μL、25mmol/LMgClz 段长度为495bp。 sly1:5'CCC,AAG,TTC,AAG,CCG,CAT,TTA 3'(1542) sly2:5'GAA,GAT,TGC,GAG,CAT,TTC,CTG 3'(2036) 5.2.2TaqDNA聚合酶。 1 GB/T 19915.9—2005 5.2.3琼脂糖：电泳级。 5.2.4溴化乙锭。 5.2.5酚：Tris饱和。 5.2.6三氯甲烷。 5.2.7异戊醇。 5.2.8异丙醇。 5.2.970%乙醇。 5.2.10分子量标记：DL-2000。 5.2.11十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)提取液：0.1mmol/LTris-HCl(pH7.5）,10mmol/LEDTA (pH 7.5),2% CTAB,0.7 mmol/L NaCl,1% β-硫基乙醇。 5.2.12TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。 5.2.1310×PCR缓冲液:100mmol/LKCl,160mmol/L（NH,),SO4，20mmol/LMgSO4， 200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),1% TritonX-100,1 mg/ mL BSA。 5.2.14电泳缓冲液：242gTris，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸馏水至 1000mL：使用时10倍稀释 5.2.15加样缓冲液：0.25%溴酚蓝.40%蔗糖 5.3仪器和设备 5.3.1离心机。 5.3.2DNA热循环仪。 5.3.3核酸电泳仪。 5.3.4 pH计。 5.3.5移液器:10μL、20μL、100μL1000uL。 5.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。 5.3.7恒温水浴锅。 5.4操作步骤 5.4.1样品处理和基因组DNA的提取 取可疑细菌的培养物1.0mL，10000r/min离心1min，沉淀用560μLTE缓冲液悬浮，或挑取可 疑细菌菌落，用560μLTE缓冲液悬浮，加人30μL10%十二烷基硫酸钠（SDS)和3μL20g/L蛋白酶 K,37℃水浴60min后，再加人100μL5mol/LNaCl和80μLCTAB/NaCl,65℃水浴10min，加人体 积比为25：24：1的酚十三氯甲烷十异戊醇混合液770μL，混匀，4℃12000r/min离心5min，取 400μL上清液；加人体积比24：1的三氯甲烷+异戊醇混合液400μL，混匀，4℃12000r/min离心 5min，取200μL上清液加人等体积的异丙醇沉淀；4℃12000r/min离心15min，弃上清；70%乙醇洗 涤一次，晾干；加入50μL双蒸水溶解沉淀。 也可用等效的DNA提取试剂盒提取DNA模板。 5.4.2PCR扩增 取比待检菌株数多两只的猪链球菌2型溶血素基因PCR反应混合物的PCR管,2000r/min离心 10s后各加人Taq酶（2.5U/μL）0.3μL，分别加人待检菌株DNA提取物和阴性、阳性核酸对照5.0μL 到PCR管中，2000r/min离心10s，立即进行PCR扩增。扩增条件为：95C预变性5min；94℃1min， 56℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。 5.4.3PCR扩增产物电泳检测 取1.5g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使 液面刚刚没过凝胶。取20uLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后加样，进行电泳。电压大小 根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm~5V/cm，电泳时间为30min～35min。将电泳好的凝胶 2 GB/T19915.9—2005 放人终浓度为1ug/mL的溴化乙锭染色缓冲液中染色15min～20min，在紫外线透射仪或凝胶成像系 统上观察结果，并做好试验记录和样品位置。 6结果及判断 6.1 试验结果成立条件 阳性对照的PCR产物电泳后在495bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后 没有条带，试验结果成立；否则，结果不成立。 6.2结果判断 带，判为该菌株含有猪链球菌2型溶血素基因 6.2.2在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在495bp的位置上未出现一条特异性 条带，判为该菌株不含有猪链球菌2型溶血素基因。 7废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。 检测过程中防止交叉污染的措施见附录A。