ICS 65.020.30 B 47 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T203952006 桑蚕微粒子病病原鉴定方法 Identification of the pathogen of pebrine for silkworm (Bombyx moril.) 2006-05-26发布 2006-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20395—2006 前言 桑蚕微粒子病是我国进境动物检疫危险性病害，为防止该病随桑蚕茧进境而传入我国，在进境动物 检疫时需正确掌握桑蚕微粒子病原孢子的检疫和鉴定方法 本标准在制定过程中，总结了多年桑蚕茧检疫的实践经验，根据桑蚕微粒子孢子的形态学特征和遇 酸溶解的化学特性，确定了检疫和鉴定桑蚕微粒子病原孢子的各项技术要求 本标准的附录A是规范性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出并归口 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 本标准主要起草人：吴希君、边玉民、李广华、王宝忠。 本标准是首次发布的国家标准。 GB/T20395—2006 桑蚕微粒子病病原鉴定方法 1 范围 本标准规定了桑蚕中微粒子病原孢子的检疫和鉴定方法。 本标准适用于桑蚕茧中感染微粒子病的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB6682一1992分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088—2000出人境动物检疫采样 3原理 微粒子病的病原体微孢子虫是一种原生动物，分类地位属于原生动物门，单丝抱子虫亚门，微抱子 虫纲，微孢子虫目，单丝孢子虫亚目，微孢子虫科，微孢子虫属。它的生活周期中有孢子、孢子发芽、裂殖 体、孢子形成期。 孢子呈卵形或长卵圆形，大小为（3.6μm～3.8μm）X（2.0μm～2.3μm），单细胞结构，见附录A。 其大小在一定范围内是相对稳定的，但由于寄主发育阶段及寄生部位不同而有差异。在显微镜下呈淡 蓝色，折光性强，密度1.30～1.35，遇酸溶解。抱子进入桑蚕消化道后，受消化液的作用而发芽，弹出极 丝，放出孢原质，进一步形成裂殖体，裂殖体常以二分裂法增殖，进入孢子形成阶段形成孢子。孢子是微 粒子原虫的休眠体。由孢子侵人蚕体至新孢子形成，一般需要4d～8d。 微粒子病的传染源包括患病的蚕、蛹、蛾的尸体、排泄物（如：蚕粪、熟蚕尿、蛾尿）、脱离物（如：蜕皮 壳、蛹壳、鳞毛等）。其传播途径主要是食入传染和胚种传染。被微粒子孢子感染的病蚕上族结茧后，随 桑蚕茧进境而传播。在进境桑蚕茧检疫工作中，该病原孢子的形态特征、特性是本标准鉴定方法的 依据。 4试剂 4.1浓盐酸(HCI)。 4.220%的氢氧化钠（NaOH）。 4.3分析用水按GB/T6682—1992规定执行。 5仪器、设备 5.1 相差显微镜 5.2生化培养箱（温控范围10℃～50℃）。 5.3冰箱。 5.4天平（感量：0.1g）。 5.5离心机。 5.6离心管。 5.7载玻片。 GB/T203952006 5.8盖玻片。 5.9量筒。 5.10研钵。 5.11手术剪、镊子。 5.12烧杯。 5.13培养皿。 5.14移液管。 5.15采样袋。 5. 16 医用纱布。 6抽样方法 6.1抽查 6.1.1抽查方法 抽查在现场进行，抽查前应对待检桑蚕茧的有关单证、产地、包装、数量等进行核实，用随机的方法 进行抽查。首先抽查蚕茧是否烘干，剪开蚕茧后，其内容物手捏成粉末状为烘干茧，而手捏发涩，甚至有 液体流出者为半干茧，烘干茧内一切病源微生物都已被灭活，半干茧内感染的微粒子孢子未被灭活，具 有传染性和致病性。 6.1.2抽查件数 按表1所列比例抽查。 表1取样、采样（GB/T18088—2000） 动物产品种类 批量货物总数/件 抽检货物的采样数/件 每份样品的量 ≤100 7 101~250 8 蚕茧 251~10000 9 10粒蚕茧 >10 000 （最多10) 6.2采样 6.2.1采样结合抽查进行，按表1所列比例采样 6.2.2采样过程中应选取半干茧（包括农药杀蛹董、日晒去湿董）、鲜及蛾作为样品，带回实验室 检验。 6.3样品的保存 现场采样后，将样品混匀后平均分成两份，一份作为检样，一份作为保存样品。检样装袋后置于 0℃～4℃冰箱中保存，以备检验。保存样品装袋经密封后，置于一18℃保存3个月。如发现桑蚕微粒子 病，该样品至少需保存6个月，以备复验、谈判和仲裁。 7显微镜检查 7.1直接检查法 从检样中取出、蛾部开后，用镊子沾取体内不同部位少许组织分别涂于不同载玻片上，加入适量 无菌水混匀，盖上盖玻片镜检（600倍以上）有无微粒子孢子。若检样中脂肪球数量过多影响镜检时，应 加人适量20%氢氧化钠充分混匀作用10min后再进行检查，直接判定。如果镜检该批检样未检出微 粒子病原抱子时，需收集检样用7.2法离心浓缩后再进一步检查。 7.2离心浓缩法 经7.1法未检出微粒子病原孢子的检样收集后，将及其他残留组织、蛾于研钵中加2倍～3倍 20%氢氧化钠溶液充分磨碎并作用10min后，加入适量无菌水充分搅拌，用两层医用纱布过滤除去残 2 GB/T20395—2006 渣，将滤液倒人离心管，以4000r/min离心10min20min，弃去上清液，加适量无菌水于离心管充分 搅拌沉淀物再离心弃去上清液，取沉淀物置载玻片上，加入适量无菌水混匀，盖上盖玻片镜检（600倍以 上）有无微粒子孢子，每个检样至少检查10个玻片。 7.3酸溶解法 镜检时有时会遇到畸形的微粒子孢子（多半是梨形或长形孢子），往往易与真菌孢子相混淆，必要时 可进行酸溶解处理，加以鉴别诊断。取检出样2滴，分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中一点加 滴浓盐酸（密度1.15），另一点作对照，在30℃生化培养箱中放置10min～20min后，然后盖上盖玻片 镜检（600倍以上）。如果试样已干，可加无菌水一滴。经过酸处理的检样，微粒子溶解消失，而真菌孢 子仍保持原状。 8结果判定 8.1直接检查法及离心浓缩法 当镜检发现孢子呈卵形或长卵圆形，大小为（3.6μm～3.8μm）×（2.0μm～2.3μm），呈淡蓝色， 折光性强，判定其为微粒子孢子（见附录A）。 8.2酸溶解法 加酸作用后.被溶解的孢子判定其为微粒子孢子