ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T21035—2007 饲料安全性评价 喂养致畸试验 Feed safety evaluation- Feeding teratogenicity test 2007-06-21发布 2007-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T21035—2007 前言 本标准是在参阅了GB15193.14一2003致畸试验及国内外相关文献的基础上，根据我国技术发展 水平研究制定的。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准负责起草单位：中国农业大学动物医学院、中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：沈建忠、肖希龙、黄齐颐、张素霞、吴聪明。 GB/T21035—2007 饲料安全性评价 喂养致畸试验 1范围 本标准规定了喂养致畸试验的基本技术要求。 本标准适用于饲料和饲料添加剂的致畸性评价。 2规范性引用文件 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14922. 1 实验动物 寄生虫学等级及监测 GB 14922.2 实验动物 微生物学等级及监测 GB 14924.1 实验动物 配合饲料通用质量标准 GB 14924.2 实验动物 配合饲料卫生标准 GB 14924.3 实验动物 小鼠大鼠配合饲料 GB 14925 实验动物 环境及设施 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 妊娠率 gestation index 妊娠鼠数占确认交配雌鼠数的百分比， 3.2 分娩率 parturition index 分娩活仔雌鼠数占妊娠鼠数的百分比。 3.3 SC 死胎率 fetal mortality 死胎仔数占分娩胎仔总数的百分比 3. 4 畸胎出现率 incidence of terata 畸胎总数占活胎仔总数的百分比。 3.5 畸胎总数 sum of terata 出现畸形的所有活胎仔数。 3.6 单项畸形出现率 incidence of singleteratosis 出现某种畸形的活胎仔数占活胎仔总数的百分比。 GB/T21035—2007 3.7 活胎仔平均畸形出现率meanincidence of teratosis 畸形总数占活胎仔总数的百分比。 3.8 畸形总数sumof teratosis 所有活胎仔出现的各种畸形种类数。 3. 9 母体畸胎出现率incidenceof terataparturition 分娩畸胎的母体数占妊娠母体总数的百分比。 4试剂及其配制 除特别注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682规定的二级用水要求。 4.1乙醇固定液：95%乙醇。 4.3氢氧化钾溶液：分别配制1%和2%两种不同浓度的氢氧化钾溶液 4.4茜素红（alizarinred)贮备液：将茜素红加人5mL乙酸、10mL纯甘油和60mL1%水合氯醛的混 合液中至饱和。 4.5茜素红应用液：取茜素红贮备液1mL，加1%氢氧化钾溶液至1000mL，用前临时配制。 4.6脱水透明液A：甘油20mL、2%氢氧化钾溶液3mL，加蒸馏水至100mL。 4.7脱水透明液B：甘油50mL、2%氢氧化钾溶液3mL，加蒸馏水至100mL。 5仪器与设备 5.1实验室常用设备。 5.2放大镜和解剖显微镜。 5.3游标卡尺（百分尺）。 6实验动物及饲养管理 常用实验动物为大鼠、小鼠。 首选大鼠，雌雄比例为1：1或2：1大鼠交配时约12～14周龄，小鼠9～10周龄。使用清洁级大 鼠和小鼠应符合GB14922.1和GB14922.2的要求。 度、湿度。笼养大鼠每笼不超过5只。饲料应符合GB14924.1GB14924.2和GB14924.3的规定 7剂量分组 至少设4组，即1个空白对照组（或溶剂对照组）和3个试验组。 试验组剂量一般选择在1/10～1/100母体LD50之间。高剂量一般应使母体产生中毒症状；低剂量 空白对照组（或溶剂对照组），必要时，还要设阳性对照组。每组孕鼠不能低于12只。 8操作步骤 8.1受试物给予与观察 一般采用混饲或混饮给予受试物。原则上雄鼠交配前4周～8周开始给予受试物直至交配成功， 确证雌鼠受孕为止。雌鼠从交配前2周～4周开始给予受试物至孕期的第13天～第15天。在试验期 间，每天观察试验鼠的体征、行为活动、采食和饮水情况。每周至少称1次体重，并同时计算采食量。 2 GB/T21035—2007 8.2受孕检查 雌、雄大鼠按1：1（或2：1)同笼后，每日早晨检查笼底有无阴道栓（石蜡状圆柱体）或用浸湿生理 盐水的棉签取阴道分泌物涂布于滴有1滴生理盐水的玻片上，置低倍显微镜下检查有无精子。发现阴 道栓或精子的当天定为孕期的0d。一般每组应获得13只～15只受孕鼠，以保证实验结束时妊娠母鼠 数不少于12只。 8.3孕鼠称重 孕鼠于孕期的0d、7d、14d和20d称重，以观察孕鼠的体重变化，随时注意记录孕鼠的状况。 8.4孕鼠处死和检查 大鼠在孕期第20天（小鼠第19天）将孕鼠处死。沿腹中线剖开腹腔，取出子宫。分别检查并记录左、 右侧卵巢黄体数、窝重（子宫连胎鼠）、子宫重、着床数、活胎数、死胎数（含早期及晚期死胎）和吸收胎数 8.5活胎鼠检查 逐个记录活胎鼠体重、性别、体长，外观检查头颅外形、面部、躯干、四肢等有无畸形，包括露脑、脑膨 出、眼部畸形（小眼、无眼、眼等）、鼻孔扩大、单鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢及尾畸形等等。 8.6胎鼠骨标本制作与检查 将每窝二分之一的活胎（奇数或偶数）放人乙醇固定液（4.1）中固定2周～3周。取出胎仔（可去 8h～72h，然后将胎仔放人茜素红应用液（4.5）中染色6h～48h，并轻摇1次/d~2次/d，至头骨染红 为宜。再将胎仔放入透明液A(4.6)中1d~2d,放入透明液B(4.7)中2d~3d,待骨骼红染而软组织 基本褪色为止。将胎仔标本放人小平皿内，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，逐步检查骨骼。 检查时先测量门的大小、失状缝的宽度、头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目、缺失 或融合（胸骨为6个，骨化不完全时首先缺第5胸骨、次缺第2胸骨），检查肋骨（肋骨通常为12对～ 13对，常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨断裂），检查脊柱发育、椎体数目（颈椎 检查四肢骨。 8.7胎鼠内脏检查 鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切。观察不同切面器官的大小、 形状和相对位置。切面制作见图1。 1一一经口从上聘与舌之间向枕部横切（切面1），可观察大脑、间脑、正脑、舌及颚裂； 2一一从眼眶前缘垂直纵切（切面2），可观察鼻道、鼻中隔； 3——从头部经眼球中央垂直纵切（切面3），可观察眼球、视网膜、膜球； 4—一从头部最大横位处纵切（切面4），可观察大脑及脑室； 5一—沿下颚水平穿过颈部横切（切面5），可观察舌、咽、气管、食管和延髓。 图1胎鼠切面制作示意图