ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T20750—2006 牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 Determination of flunixin meglumine residue in bovine muscle tissue- LC-UV method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20750—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、李军、宋文斌、董振霖、李一尘、薛大方、干一荠， 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T20750—2006 牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 1范围 本标准规定了牛肌肉中氟胺烟酸残留量的液相色谱-紫外检测法。 本标准适用于牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定。 本标准的方法检出限为：0.005mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测定方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987) 3原理 样品中氟胺烟酸采用β-葡萄糖苷酸酶降解，然后用乙腈提取、浓缩，磷酸盐缓冲溶液溶解，SPE-C18 净化和富集，利用适当的洗脱溶剂对固相萃取柱上富集的组分进行选择性淋洗，通过高效液相色谱的紫 外检测器进行分析测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所有试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲酸。 4.2冰乙酸。 0.0500gβ-葡萄糖苷酸酶于5mL玻璃试管中,加2mL的磷酸盐（PBS)缓冲溶液溶解，用0.45uμm尼 龙滤膜过滤。使用前现配制。 4.4葡萄糖。 4.5浓盐酸。 4.6流动相A：乙酸铵0.05mol/L，pH5.0准确称取3.90g乙酸铵于1000mL的烧杯中，加900mL 水溶解并用甲酸调整至pH5.0,转移至1000mL容量瓶中，使用前过0.45um滤膜。 4.7流动相B甲醇，色谱纯。 4.8流动相C：乙睛，色谱纯。 4.9混合流动相：将40mL流动相B,30mL流动相C以及30mL流动相A相混合。 4.10磷酸盐(PBS)缓冲溶液：称取0.8g氯化钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,0.115g磷酸氢 二钠和0.02g葡萄糖于250mL烧杯中加约90mL的水溶解，用0.1mol/L磷酸调整pH6.0,转移至 GB/T20750—2006 100mL容量瓶中并稀释至刻度。 4.1185%磷酸。 4.12乙酸钾溶液：0.04mol/L。称取1.95g乙酸钾于500mL容量瓶中，加约450mL水溶解并稀释 至刻度。 4.13氯化钾。 4.14磷酸二氢钾。 4. 15 5磷酸二氢钾缓冲溶液：0.25mol/L，pH7.0。称取17.01g磷酸二氢钾溶于400mL水中，定容到 500mL，然后用0.25mol/L磷酸氢二钠调节pH至7.0（约500mL），定容到1L。 4. 16 氯化钠。 4. 17 无水磷酸氢二钠。 4.18 磷酸氢二钠溶液：0.25mol/L。称17.75g磷酸氢二钠溶于400mL水中，定容到500mL。 4.19 乙酸正已烷溶液：乙酸十正已烷（10十90）。 4.20 正已烷：色谱纯。 4.21 标准物质：氟胺烟酸，纯度>99%。 4. 22 标准储备液：50ug/mL。称取适量的氟胺烟酸标准物质，用甲醇配成50ug/mL的标准储备液。 2℃～4℃保存，有效期为3个月。 注：称取标准物的质量是按纯度修正过的质量 4.23标准工作溶液：2μg/mL。吸取适量的氟胺烟酸的标准储备液（4.22），用甲醇配制成2uμg/ml 的混合标准工作溶液，2℃～4℃保存，有效期为1个月 4.24标准基质溶液：根据氟胺烟酸的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配制成不同浓度 (μg/mL)标准基质溶液。 5仪器 5.1 液相色谱仪：配有紫外检测器。 5.2电子天平：感量为0.01g和0.0001g。 5.3离心机：最大转速为10000r/min。 5.4离心管：50mL聚丙烯离心管。 SAC 5.5 均质机。 5.6振荡器。 5.7 微量移液器：10μL~100μL和1000μL~5000μL。 5. 8 氮气浓缩仪。 5.9 酸度计：测量精度为士0.02。 5. 10 样品过滤器：PTFE0.45μm。 5. 11 固相萃取柱：BondElutCertifyIl,3mL,200mg或相当者。 5. 12 真空固相萃取装置。 5.13旋转蒸发仪。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 去掉牛肌肉中的骨头和皮，将其搅拌均匀。分出0.5kg作为试样，将制备好的试样密封，并贴上 标签。 6.2试样的保存 将试样置于一18℃条件下贮存。 2 GB/T20750—2006 7分析步骤 7.1提取 称取2.0g试样，于50mL聚丙烯离心管中，加入乙酸钾溶液（4.12)5mL，高速旋涡混合10s。混 合后向样品中加人30μL乙酸，调节样品pH至4.5，旋涡混合。再加入70uL新配制的β-葡萄糖苷酸 酶溶液（4.3）混合，于振荡器37℃条件下低速振荡16h。分别向样品中加入5mL乙腈，旋涡混合5s， 离心10min（3200r/min）。转移上清液至50mL离心管中。在原液中加人5mL乙睛和1mL乙酸钾 溶液（4.12)旋涡混合，离心，将上清液转移至50mL离心管中，合并上清液，待净化 7.2净化 在混合的上清液中加人5mL正已烷和50μL浓盐酸，旋涡混合15s，离心5min（3200r/min）。 弃去正已烷层，重复上述步骤一次。55℃条件下氮吹使其体积小于5mL。加入磷酸二氢钟缓冲溶液 （4.15）7mL，旋涡混合，超声20s，5℃条件下离心15min（3200r/min）。采用固相萃取柱（5.11），用 液。加大真空度抽滤10min。用2mL正已烷淋洗柱子两次并弃去淋洗液。用2mL乙酸正已烷溶液 （4.19）洗提柱子两次，用15mL离心管收集洗脱液。在55℃条件下将洗脱液氮吹至干。随后，在每个 样品中加人混合流动相（4.9)1mL，旋涡混合5s，超声5s。样液用0.45um的滤膜过滤到进样瓶中， 待测。 SZG 7.3测定 7.3.1液相色谱测定条件 a) 色谱柱：Inertsil,ODS-3,250mm×4.6mm，5μm，或相当者； b) 流速：0.4mL/min； 检测波长：285nm； c) d) 柱温：35℃； e) 进样量：20μL； 运行时间：20min； 延迟时间：10min。 g) 7. 3. 2 液相色谱测定 用氟胺烟酸的标准基质溶液（4.24)分别进样，以峰面积和工作标准溶液浓度绘制标准工作曲线，样 品溶液中氟胺烟酸的响应值应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，氟胺烟酸保留时间约为 13.0min，标准物质色谱图参见图A.1。氟胺烟酸的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表B.1。 7.4平行试验 按照上述步骤，对同一试样进行平行试验。 7.5回收率试验 空白样品中添加标准溶液按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率 8结果计算 按式（1)计算试样中氟胺烟酸的残留量： <V×1000 X=cX .....(1) m^1000 式中： X—一试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）； c——从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)； V一样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）； 3