ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 20743—2006 猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of bacitracin residues in porcine liver, kidney and muscle tissues- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 20743—2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、山东农业大学。 本标准主要起草人：庞国芳、范春林、连玉晶、李岩、郑军红、曹彦忠、张进杰、李学民、刘永明。 本标准系首次发布的国家标准 GB/T20743—2006 猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定（本方法测定杆菌肽中主要成分杆菌肽A）。 本标准的方法检出限：50.0μg/kg。 2规范性引用文件 STC 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987) 3原理 试样中杆菌肽残留用酸化的甲醇水匀浆提取，经双硫三氯甲烷溶液进行液液分配净化后，再经固 相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2三氯甲烷：色谱纯。 4.3甲酸。 4.4、双硫：优级纯。 4.5杆菌肽标准物质：纯度≥92.0%。 4.6甲醇十水（1十1)：量取250mL甲醇（4.1)与250mL水混合。 4.70.3%甲酸溶液：移取3mL甲酸（4.3)于装有约800mL水的1L容量瓶中，用水定容至刻度并混匀。 4.80.1%甲酸甲醇溶液：移取1mL甲酸于装有约800mL甲醇的1L容量瓶中,用甲醇定容至刻度 并混匀。 4.90.0025%双硫腺三氯甲烷溶液：称取0.025g双硫粽（4.4）于装有约800mL三氯甲烷（4.2）的 1L容量瓶中，用三氯甲烷定容至刻度并混勾。 4.10饱和双硫腺三氯甲烷溶液：移取适量的0.0025%双硫腺三氯甲烷溶液于盛有约100mL甲醇+ 水（1十1）的250mL分液漏斗中，振摇1min，静置分层，取下层溶液备用。 4.11杆菌肽标准储备溶液：准确称取适量的杆菌肽于50mL容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液配制成 浓度为0.1mg/mL的标准储备溶液。储备液在2℃～4℃保存，可用3个月。 1 GB/T 20743—2006 4.12杆菌肽标准工作溶液：移取杆菌肽标准储备溶液1.0mL于10mL容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇 溶液定容，配制成浓度为10.0mg/L的标准工作溶液，在2℃～4℃保存，可用1周。 4.13杆菌肽基质标准工作溶液：根据需要吸取适量的杆菌肽标准工作溶液，用空白样品提取液稀释成 适当浓度的基质标准工作溶液，当天配制。 4.14OasisHLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。使用前分别用3mL甲醇和3mL水预处理，并 保持柱体湿润。 5仪器 5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3高速组织捣碎机：转速不低于10000r/min。 5.4振荡器。 5.5离心机：转速不低于4000r/min。 5.6 离心管：10mL和60mL，具塞。 5.7 贮液器：50mL。 5.8 固相萃取真空装置。 5.9氮气吹干仪。 5.10微量注射器：25μL，100μL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 猪肝脏、肾脏要去除脂肪和其他的非肝脏、肾脏组织，猪肉要去皮和骨头，将其搅碎拌匀，分出 0.5kg作为试样，将制备好的试样密封，并做上标记 6.2试样保存 将试样置于一18℃条件下保存。 7测定步骤 7.1提取 （1+1），于高速组织捣碎机上匀浆提取1min，然后加入20mL经甲醇十水（1十1）饱和的0.0025%双 硫腺三氯甲烷溶液，于振荡器上剧烈振荡10min，以4000r/min离心10min，取上清液10mL于 50mL试管中，弃去其余上清液 往上述双硫三氯甲烷溶液中加人30mL水，捣碎残渣，置于振荡器上剧烈振荡10min，移取全部 上清液于另一60mL离心管中。重复提取一次，合并上清液，混匀，以4000r/min离心10min，取上清 液30mL与50mL试管中的提取液合并，混匀。 7.2净化 在预处理过的固相萃取柱顶部连接贮液器，移入上述试管中样液，待样液全部通过萃取柱后，加人 2mL水，弃去全部流出液。然后，将固相萃取柱在50kPa～55kPa的负压下抽干1h，最后用2mL甲 醇洗脱，收集洗脱液于10mL试管中，洗脱液在35℃水浴中用氮气吹干，用0.5mL甲醇重新溶解残 渣，再加人0.5mL0.3%甲酸溶液，摇匀后，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 a）色谱柱：InertsilODS-3,5.0μm，150mm×2.1mm(内径）或相当者； 2 SAG GB/T 20743—2006 b) 液相色谱梯度洗脱条件见表1； 柱温：40℃； c) d) 进样量：20μL。 表1液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 水（含0.3%甲酸)/(%) 流速/（μL/min） 甲醇/（%) 0.00 400 95.0 5.0 5.00 400 50.0 50.0 20.00 400 50.0 50.0 20.10 400 95.0 5. 0 25. 00 400 95.0 5. 0 7. 3. 2 质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源； SIC b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测； d) 电喷雾电压：5500V； e) 碰撞气压力：410kPa； f) 雾化气压力：690kPa； g) 气帘气压力：410kPa； h) 辅助加热气压力：690kPa i) 离子源温度：700℃； j) 定性离子对、定量离子对和去簇电压（DP）、聚焦电压（FP）、碰撞气能量（CE）及碰撞室出口电 压(CXP)见表2。 表 2 杆菌肽的定性离子对、定量离子对、去簇电压、聚焦电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压 定性 定量 去簇 聚焦 碰撞气 碰撞室 名 称 离子对 离子对 电压(DP)/ 电压（FP)/ 能量(CE)/ 出口电压（CXP）） (m/2) (m/2) v V V V 73 712.3/227.2 杆菌肽 712.3/199.2 52 90 48 7 712.3/356.2 43 3 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 用5个不同浓度的杆菌肽基质标准工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为 纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中杆菌肽的响应值均应在仪器 测定的线性范围内。在上述色谱条件下，杆菌肽的总离子流图参见图A.1。杆菌肽的保留时间为 8.49 min。 本方法的添加回收率数据参见表B.1。 7.4平行试验 按上述步骤，对同一试样进行平行试验。 7.5空白试验 除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。 3