ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T20744—2006 蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of metronidazole,ronidazole and dimetridazole residues in honey- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 20744—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、山东农业大学。 本标准主要起草人：庞国芳、刘永明、曹彦忠、范春林、张进杰、李学民、吴艳萍、李金、连玉晶、林忠。 本标准系首次发布的国家标准 GB/T20744—2006 蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准适用于蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑残留量的测定。 本标准的方法检出限：甲硝唑检出限为0.1ug/kg；洛硝哒唑和二甲硝咪唑检出限均为0.2μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004ISO5725-2:1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 蜂蜜中三种硝基咪唑类药物残留用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后，经过固相萃取柱净化，液相色谱 串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3乙酸乙酯：色谱纯。 4.4甲酸：优级纯。 4.5无水硫酸钠：分析纯。在650℃马弗炉中灼烧6h，贮存于干燥器中。 4.6 洗脱剂：甲醇+乙+0.1%甲酸水（40+18十42）。 4.7 甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑标准物质：纯度≥98%。 4.8甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取适量的甲硝唑、洛硝哒唑、 二甲硝咪唑标准物质，分别用甲醇配成标准储备液。储备液在低于4℃时可保存两个月。 4.9甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑混合标准工作溶液A和B：根据需要吸取适量甲硝唑、洛硝哒唑、 二甲硝咪唑标准储备溶液，用甲醇稀释成甲硝唑为1.0ug/mL，洛硝哒唑和二甲硝咪唑均为2.0μg/mL 的混合标准工作溶液A。再吸取适量混合标准工作溶液A用甲醇稀释成甲硝唑为0.010μg/mL，洛硝 哒唑和二甲硝咪唑均为0.020μg/mL的混合标准工作溶液B。混合标准工作溶液A和B应现用现配。 4.10甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑混合基质标准工作溶液：根据需要吸取适量甲硝唑、洛硝哒唑、二 GB/T20744—2006 甲硝咪唑混合标准工作溶液A和B,用空白样品提取液稀释成浓度分别为0.25ng/mL、0.50ng/mL、 1.00ng/mL、5.00ng/mL的混合基质标准工作溶液。混合基质标准工作溶液应现用现配。 4.11BAKERBONDCarboxylicAcid固相萃取柱或相当者：500mg，3mL。使用前用4mL乙酸乙酯 预处理，保持柱体湿润。 4.12滤膜0.20μm。 5仪器 5. 1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2 分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3 液体混匀器。 5.4 固相萃取真空装置。 5.5振荡器。 5.6 具塞玻璃离心管：50mL。 5.7 真空泵：真空度应达到80kPa。 5.8 离心机。 5.9 旋转蒸发器 厂刻度样品管：5mL。 5. 10 5.11 梨形瓶：150mL。 5. 12 筒形漏斗。 6试样的制备与保存 6.1 试样的制备 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴 中温热，振荡，待样品全部融化后搅勾，迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样 品瓶中，密封，并做上标记。 6.2试样保存 将试样于常温下保存。 7测定步骤 7.1提取 称取10g试样（精确到0.01g)置于50mL具塞玻璃离心管中，加入10mL水，在液体混匀器上混 匀，加20mL乙酸乙酯，于振荡器上振荡20min，以3000r/min离心5min，取上清液过盛有25g无水 硫酸钠筒形漏斗至梨形瓶中。再用20mL乙酸乙酯提取一次，过无水硫酸钠筒形漏斗，合并上清液，用 旋转蒸发器于45℃水浴上减压蒸发至约2mL，待净化。 7.2净化 将上述浓缩液移至CarboxylicAcid固相萃取柱中，再分别用4mL乙酸乙酯和4mL乙腈洗涤梨 形瓶和萃取柱，弃去全部流出液。在65kPa的负压下，减压抽干萃取柱2min，用2mL洗脱剂以 ≤3mL/min流速洗脱，收集洗脱液于5mL刻度样品管中，用洗脱剂定容至2mL，过0.20um滤膜，供 液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱：AtlantisdCis，3μm，150mm×2.1mm(内径）或相当者； b) 流动相：乙腈+0.1%甲酸水（30+70）； 2 GB/T 20744—2006 流速：200μL/min； c) 柱温：30℃； d) e) 进样量：20μL。 7.3.2 质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ESI)； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测； d) 电喷雾电压：5500V； e) 雾化气压力：0.069MPa； f) 气帘气压力：0.069MPa； 辅助气流速：6L/min； g) h) 离子源温度：700℃； i) 定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞能量见表1。 表1三种硝基咪唑药物的质谱参数 中文名称 英文名称 定性离子对(m/2) 定量离子对(m/=） 去簇电压/V 碰撞能量/V 172.1/128.1 30 19 甲硝唑 metronidazole 172.1/128.1 172.1/82.1 30 34 201.1/140.2 26 14 洛硝哒唑 ronidazole 201.1/140.2 201.1/110.1 26 20 142.2/96.1 40 22 二甲硝咪唑 dimetridazole 142.2/96.1 142.2/81.2 40 40 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 在仪器最佳工作条件下，用甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑混合基质标准工作溶液分别进样，以峰面 积为纵坐标，混合基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定 量，样品溶液中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑的响应值均应在仪器测定的线性范围内。甲硝唑、洛硝哒 甲硝咪唑的参考保留时间见表2。 表 2 三种硝基咪唑药物的参考保留时间 中文名称 保留时间/min 甲硝唑 2.80 洛硝哒唑 3.12 二甲硝咪唑 3.57 本方法的添加回收率数据参见附录B。 7.4平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 7.5空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。 8结果计算 结果按式(1)计算：