ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 20747—2006 牛和猪肌肉中安乃近代谢物残留量 的测定 液相色谱-紫外检测法和 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of metabolite residues of dipyrone in bovine and porcine muscletissues- LC-UV and LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20747—2006 前言 本标准的附录A、附录B、附录 C和附录 D为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、谢丽琪.沈金灿、林燕奎、陈佩金、韩瑞阳， 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T20747—2006 牛和猪肌肉中安乃近代谢物残留量 的测定液相色谱-紫外检测法和 液相色谱-串联质谱法 第一法液相色谱法 1范围 本部分规定了牛和猪肌肉中安乃近代谢物4-甲酰氨基安替比林（4-formylaminoantipyrine）、4-甲基 氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine）和4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine）的液相色谱测定方法。 的测定。 本部分的方法检出限：4-甲酰氨基安替比林为12.5μug/kg，4-氨基安替比林为15.0μg/kg，4-甲基 氨基安替比林为20.0μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2：1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 肌肉中安乃近代谢物残留用硫酸钠溶液（pH=7)提取，过滤后经BondElutCis固相萃取柱或相当 者净化，用甲醇洗脱，氮气吹干。残渣用甲醇十水溶解，供液相色谱仪测定。4-甲酰氨基安替比林用外 标法定量、4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林用内标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3硫酸钠。 4.4亚硫酸钠。 4.5乙酸铵：色谱纯 4.6硫酸钠+亚硫酸钠提取溶液：准确称取14.20g无水硫酸钠和2.52g亚硫酸钠，用水溶解，并使 其体积达到约950mL,然后用0.5mol/L的稀硫酸调节溶液的pH值至7.0,用水定容至1000mL。 4.7淋洗液：甲醇+水（5十95）。 1 GB/T20747—2006 4.8样品定容液：甲醇+水（1十9）。 4.94-甲基氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-氨基安替比林标准物质：纯度≥99%。 4.10内标标准物质：4-异丙基氨基安替比林（4-isoproylaminoantipyrine），纯度≥99% 4.11标准储备溶液：100mg/L。准确称取适量的各种安乃近代谢物标准物质（4.9），用甲醇（4.1)配 制成浓度为100mg/L的标准储备溶液，避光一18℃保存，可使用3个月。 4.12混合标准储备溶液：10.0mg/L。吸取每种适量标准储备溶液（4.11)，用甲醇稀释成10.0mg/L 的混合标准工作溶液，避光一18℃保存，可使用1个月。 4.13内标储备溶液：100mg/L。准确称取适量的内标标准物质（4.10）用甲醇（4.1）配制成浓度为 100mg/L内标储备溶液，避光一18℃保存，可使用1个月 4.14内标工作溶液：2.0mg/L。吸取适量的内标储备溶液（4.13）,用甲醇稀释成2.0mg/ml.的内标 工作溶液，避光一18℃保存，可使用1个月 4.15混合标准工作溶液：分别移取不同量混合标准储备溶液（4.12）于进样瓶中，再分别加人适量内标 工作溶液（4.14），用样品定容液（4.8）定容至1mL，使各被测组分的浓度均为0.010ug/mL、 0.050μg/mL0.10μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL,内标物质浓度均为0.25μg/mL。 4.16BondElutCig固相萃取柱或相当者：500mg，3mL。用前分别用5mL甲醇和5mL水处理，保 持柱体湿润。 4.17滤膜：0.45μm。 4.18玻璃滤纸。 5仪器 5.1 液相色谱仪：配有紫外检测器。 固相萃取装置。 5.2 5.3 氮气浓缩仪 5.4 液体混匀器。 5.5分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.6真空泵。 5.7 均质器。 5.8 移液器：10μ~100μL和100μL~1000μL 5.9 聚丙烯离心管：50mL，具塞。 5. 10 pH计：测量精度士0.02pH单位。 5. 11 低温离心机：可制冷到4℃。 5. 12 玻璃离心管：15mL。 6试样的制备与保存 6. 1 试样的制备 取有代表性的牛或猪肌肉，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记。 6.2试样保存 制备好的试样置于一18℃冰柜中避光保存。 7测定步骤 7.1提取 称取5g试样，精确至0.01g。将上述样品置于50mL聚丙烯离心管（5.9)中，加入0.25mL浓度 为2.0mg/L的内标工作溶液（4.14），然后加人15mL硫酸钠+亚硫酸钠提取溶液（4.6），均质1min， GB/T20747—2006 在10℃以4000r/min离心5min。将上清液转移到另一个干净的50mL容量瓶中，残渣再分别加人 15mL、10mL硫酸钠十亚硫酸钠提取溶液提取两次，离心后，合并上清液，并用硫酸钠十亚硫酸钠提取 溶液定容至50mL，混合均匀，然后用玻璃滤纸过滤，待净化。 7.2净化 取25mL提取液（7.1)放入Cl8固相萃取柱（4.16)中，以约1mL/min的流速使样液通过固相萃取 柱，待样液全部通过后，依次用5mL水和5mL甲醇十水淋洗液（4.7）淋洗固相萃取柱，弃去全部流出 液，减压抽干固相萃取柱10min。最后用5mL甲醇洗脱，洗脱液收集于15mL玻璃离心管中，置于氮 气浓缩仪（5.3）上在55℃吹至近干，用样品定容液（4.8)定容至1.0mL。定容液混匀后，过0.45um滤 膜，供液相色谱测定。 7.3测定 7.3. 1 液相色谱条件 色谱柱：InertsilODS-3色谱柱，5μm，250mm×4.6mm或相当者； b) 柱温：30℃； c) 进样量：50μL； (P 流动相、流速及梯度洗脱条件见表1； e) 检测波长：265nm。 表1梯度洗脱条件 时间/min 流速/(mL/min) 水/(%) 甲醇/（%） 0 1. 0 90 10 15 1. 0 30 70 17 1. 0 5 95 18 1. 0 06 10 23 1. 0 90 10 7.3.2液相色谱测定 将混合标准工作溶液分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作 曲线对样品进行定量，样品溶液中4-甲酰氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林的响应 值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，4-甲酰氨基安替比林的参考保留时间为 10.61min,4-氨基安替比林的参考保留时间为13.60min，4-甲基氨基安替比林的参考保留时间为 14.76min，内标化合物的参考保留时间为17.55min。安乃近代谢物标准物质的色谱图参见图A.1. 4-甲酰氨基安替比林采用外标法定量；4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林采用内标法进行定 量。本方法的添加回收率数据参见附录C。 7.4平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 7.5回收率试验 溶液。阴性样品中添加标准溶液，按7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。 8结果计算 4-甲酰氨基安替比林结果按式（1)计算： Vx1000 X=cX ..(1) 1000 m 3