ICS 07. 100. 01 D 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T20929—2007 嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其活性的 基因芯片检测方法 The methods of testing acidithiobacillus ferrooxidans and its activity by microarray technology 2007-04-30发布 2007-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20929—2007 前言 本标准由中国有色金属工业协会提出。 本标准由全国有色金属标准化技术委员会归口。 本标准由中南大学资源加工与生物工程学院负责起草 本标准主要起草人：邱冠周、刘学端、柳建设、刘新星、申丽、王军。 本标准由全国有色金属标准化技术委员会负责解释。 GB/T20929—2007 引言 生物冶金是利用以矿物为营养基质的微生物将矿物氧化分解，从而使金属进人溶液，通过进一步分 离、富集、纯化而提取金属的高新技术，它具有流程短、成本低、环境友好和低污染等优点，尤其在低品 位、复杂难处理矿产资源的开发利用中，显示出强大的优势，可以大幅度提高矿产资源的开发利用率和 资源的保障程度。 生物治金速度慢、浸出率低是国际上未能解决的难题。特别是原生矿（如黄铜矿CuFeSz）生物冶金 速度慢的问题最为突出，主要原因是缺乏高效的浸矿微生物菌种，其关键是没有一个统一的来自微生物 本身的标准来评判微生物浸矿性能。 2000年以来，中南大学开展了模式嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC23270的研究，获得了该菌3217个 基因序列信息。本标准是以该菌作为模式菌，利用基因芯片技术，建立嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其活性的 基因芯片检测方法。 GB/T20929—2007 嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其活性的 基因芯片检测方法 1范围 本标准规定了利用基因芯片技术检测嗜酸氧化亚铁硫杆菌（以下简称A.f菌）及其活性的术语、定 义、符号、省略语、主要技术指标和待测样品的要求、样品图谱的制作及分析方法。 本标准适用于利用基因芯片技术来高效快速的鉴别A.f菌，并确定待测样品中A.f菌株的氧化 活性。 2方法原理 A.f菌的浸矿性能与其对亚铁和硫的氧化能力及其环境适应性相关，而这些特征主要受基因控制。 利用获得的纯A.f标准菌ATCC23270及其全部3217个基因序列信息构建高通量的基因芯片技术， 通过不同活性类型（高氧化活性菌和低氧化活性菌）A.f菌与基因芯片杂交，找到高氧化活性菌的特征 基因及其与浸矿作用密切相关的功能基因的表达情况，根据待测样品特征基因的有无和比例以及功能 基因的表达水平评定A.f菌的浸矿性能。 3术语和定义 下列术语、定义、符号和缩略语适用于本标准。 3. 1 A.f 菌acidithiobacillus ferrooxidans 属于原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属，革兰氏阴性，有鞭毛。该菌好氧嗜酸、化能自养 能氧化金属硫化物，将Fe2+氧化成Fe3+，将还原态的硫氧化成SO,²-，是生物冶金中最常用的菌种。 3. 2 基因芯片microarraytechnology 将大量基因片段以预先设计的方式固定在片基上组成的密集分子排列。 3. 3 基因芯片图谱microarraygeneexpressionprofiles 将荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子杂交后，通过激光共聚焦扫描所获得的图像和数据。 3. 4 生物冶金biohydro-metallurgy 一种利用以矿物为营养基质的微生物，将矿物氧化分解后，再进一步分离提取金属的工艺。 3. 5 探针probe DNA探针是指能识别特定碱基序列的经过人工标记的一小段单链DNA分子，即一段与被测定的 核苷酸序列(靶序列)互补的带标记的单链脱氧核糖核苷酸。 3.6 荧光标记labellingusingfluorescent dyes 在基因组DNA扩增过程中，将带有Cy3(4.1.14)或Cy5(4.1.13)荧光素的dUTP或dCTP加人到 新合成的DNA链，使新合成的DNA链带有荧光标识。 1 GB/T20929—2007 3.7 基因芯片杂交microarrayhybridization 使带有荧光标记的gDNA/cDNA与基因芯片上的探针进行特异性互补结合的过程。 3. 8 基因芯片扫描 microarray scanning 将杂交后的基因芯片置于芯片扫描仪内获得不同探针杂交信号强度的全貌图。 3. 9 富集培养enrichmentculture 利用不同微生物间生命活动特点的差异，制定特定的培养条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生 长，从而使其在群落中的数量大大增加，并能更容易分离到所需的特定微生物。 3. 10 纯培养 pureculture 在人为规定的条件下培养，由单一细胞繁殖所获得目的细菌的技术。 3. 11 扩大培养 propagateculture 将纯培养的细菌置于培养基以增加纯培养中菌株数量的技术， 3. 12 SAG A.f模式菌（ATCC23270） 确定A.f种的特性所选用的代表性菌株。 3.13 PCR(Polymerase chain reaction) 即DNA聚合酶链反应，是一种特异性DNA序列的体外酶促合成与扩增技术。 3.14 rep-PCR(Repetitive Element Sequence-Based PCR) 利用REP序列引物扩增细菌基因组DNA的重复性元件，经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性的一种 鉴定微生物的方法。 3.15 box-PCR 利用BOX序列引物扩增细菌基因组DNA的重复性元件，经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性的一种 鉴定微生物的方法。 3. 16 A260/A280 样品在260nm处的光吸收值与280nm处的光吸收值的比值。 3. 17 A260/A230 样品在260nm处的光吸收值与230nm处的光吸收值的比值。 4试剂和材料 本试验所用水为高纯水（电阻率大于18Mα2)。 4.1试剂 4.1.1十二烷基磺酸钠SDS，分子式：CH3（CH，）1oCH,SONa浓度（质量分数）：0.2% 4.1.2硫酸亚铁FeSO4 4. 1.3苯酚 C.H,OH 2