ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 20749—2006 牛尿中β-雌二醇残留量的测定 气相色谱-负化学电离质谱法 Method for determination of β-estradiol residues in bovine urine- gas chromatography-negative-ion chemical ionization mass spectrometry method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 20749—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、王建华、李杰.刘靖靖、蔡发 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T20749—2006 牛尿中β-雌二醇残留量的测定 气相色谱-负化学电离质谱法 1范围 本标准规定了牛尿中3-雌二醇残留量气相色谱-负化学电离质谱测定方法。 本标准适用于牛尿中β-雌二醇残留量的测定。 本标准的方法检出限：0.25μg/L。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987) 3原理 牛尿中雌二醇经过酶水解和固相萃取柱净化后、经酰化衍生化后，用气相色谱-负化学电离质谱选 择离子监测模式测定，内标法定量。 4试剂和材料 除另有规定外，试剂均为分析纯；水为GB/T6682规定的一级水。 4.1β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶：Helixpomatia，含β-葡糖苷酸酶100 000单位/mL,硫酸酯酶 ≤1000单位/mL。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3四丁基甲醚（MTBE)：色谱纯。 4.4乙酸乙酯：色谱纯。 4.5正已烷：色谱纯。 4.6 吡啶：色谱纯。 4.7 异辛烷：色谱纯。 4.8 衍生化试剂：五氟苯甲酰氯，在避光、防潮环境冷冻储藏。 4.9 碳酸氢钾。 三水乙酸钠。 4. 10 4.11无水硫酸钠。 4. 12 甲醇+水溶液（1十1）：取100mL甲醇（4.2）和100mL水充分混合。 4. 13 甲醇十四丁基甲醚溶液（1十9）：取20mL的甲醇（4.2)和180mL四丁基甲醚（4.3）充分混合。 4. 14 乙酸钠缓冲液（pH=5.2）：称取43g三水乙酸钠（4.10)用水溶解，加人25.2g冰乙酸用水定容 GB/T20749—2006 至1000mL，有效期6个月。 4.15干燥乙酸乙酯：在密封试管中加入500mg无水硫酸钠和20mL乙酸乙酯，振荡混合约30min 后，2000r/min离心10min。 4.16乙酸乙酯十吡啶（90十10）：将10mL吡啶和90mL干燥的乙酸乙酯混合，室温保存。一周内 使用。 4.17碳酸氢钾（KHCO）溶液：0.5mol/L。称5gKHCO，于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。 二周内有效。 4.18OasisHLB固相萃取柱：60mg，3mL或相当者。使用前分别依次用3mL四丁基甲醚（4.3）， 3mL甲醇（4.2），3mL纯水活化，保持柱体湿润 4.19标准物质：β-雌二醇，纯度≥99%。 4.20内标标准物质：β-雌二醇-2,4，16,16-D4，纯度≥99%。 4.21β-雌二醇标准溶液：准确称量10mg标准物分别于100mL容量瓶中，用甲醇（4.2）定容至刻度， 浓度100ug/mL，储备液贮存于一20℃，有效期一年。再以甲醇稀释成适用浓度的溶液，保存于4℃冰 箱中。 4.22内标标准溶液：准确称量10mg标准物分别于100mL容量瓶中，用甲醇（4.2）定容至刻度，浓度 100μg/mL，储备液贮存于一20℃，有效期一年。再以甲醇稀释成适用浓度溶液，保存于4℃冰箱中，可 使用三个月。 备用。 5仪器 5.1气相色谱-质谱仪：配有负化学源。 5.2离心管：5mL和10mL,具塞。 5.3移液器：20uL~100uL，200uL~1000μL 5.4分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.5离心机。 5.6涡旋混匀器。 5.7氮气浓缩仪。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 取有代表性样品，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记。 6.2试样保存 将试样置于2℃～8℃下保存。 7测定步骤 7.1提取 准确移取2.0mL牛尿，置于5mL具塞离心管中，加人2mL乙酸钠缓冲液（4.14）、20μLβ-葡糖 苷酸酶和芳基硫酸苷酶（4.1）、100μL内标溶液（4.22）于每个样品中，混匀，于37℃过夜。 7.2净化 将提取液（7.1)移入下接OasisHLB柱（4.18）的贮液器中，溶液以≤1mL/min的流速通过Oasis HLB柱，待溶液完全流出后，用甲醇十水（4.12）洗柱，弃去全部淋出液。最后用6mL甲醇十四丁基甲 醚（4.13）洗脱，收集洗脱液于10mL具塞离心管（5.2）中，用氮气浓缩仪（5.6）吹至约剩余500μL溶 GB/T20749—2006 液。加入2×2mL异辛烷于上述10mL离心管中提取两次，以2000r/min离心5min。取上层液体于 5mL具塞离心管（5.2），于40℃下氮气吹干。 7.3衍生化 在上述5mL具塞试管中依次加入85μL干燥乙酸乙酯（4.15），500μL乙酸乙酯十吡啶（4.16）， 20μL五氟苯甲酰氯（4.8），混匀，于60℃放置20min后，用氮气浓缩仪吹干。加入500μL0.5mol/L KHCO：溶液（4.17），涡旋振荡，待溶液澄清后，准确加入0.4mL异辛烷，混合提取，静置，取上清液进 行测定。 7.4测定 7.4.1气相色谱-质谱测定条件 a) 色谱柱：HP-5MS（30mX0.25mmX0.25μm）石英毛细管柱或相当者； b) 载气：氨气，纯度≥99.999%； c) 流速：初始流速1.0mL/min，保持5min，然后以1.0mL/min速度升至3mL/min； d) 柱温：120℃保持2min，然后以15℃/min程序升温至250℃，再以5℃/min升温至300℃保持 8 min; e) 进样量：1μL； f) 进样方式：无分流进样； 进样口温度：300℃； g) h) 接口温度：280℃； i) 负化学源：150eV； j) 离子源温度：150℃； k) 四极杆温度：106℃； 1) 反应气：甲烷，纯度≥99.99%； m) 反应气流量：2mL/min； n) 选择离子监测，见表1。 表1选择离子监测表 监测离子（m/z） 离子比/（%） 允许相对偏差/（%） 660 100 661 40 ±20 448 80 ±20 450 44 ±20 7.4.2定性测定 定性测定的依据为： 被测样品色谱峰的保留时间与标准工作溶液相一致； a) b) 所选择的离子均出现，被测样品的监测离子的相对丰度与标准工作溶液的相对丰度两者之差 不大于允许相对偏差（7.4.1)。 7.4.3定量测定 配制系列标准工作溶液（4.23）分别进样，仪器测定β-雌二醇以m/≥660为定量离子，内标β-雌二醇 D4以m/664为定量离子，以峰面积比对浓度绘制标准工作曲线，用标准工作曲线内标法对样品进行 定量，样品溶液中待测物质的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，雌二醇衍生物 参考保留时间约为26min。雌二醇和内标衍生物总离子流图和质谱图参见图A.1、图A.2、图A.3。 7.5平行试验 以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 3