ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T20751—2006 鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of 15 quinolone residues in eels and eel products- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20751—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫 局、食品安全分析与检测技术教育部重点实验室（福州大学）。 本标准主要起草人：庞国芳、杨方、刘正才、余孔捷、卢声宇、李耀平、陈国南 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T20751—2006 鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准适用于鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物的测定。 本标准的方法检出限：十五种喹诺酮类药物的检出限均为5μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987) 3原理 试样中残留的喹诺酮类药物采用乙睛提取，提取液经正已烷液液分配脱脂后，以强阳离子固相萃取 小柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙睛：色谱纯。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3正已烷。 4.4、浓氨水。 4.5甲酸。 4.6乙酸铵。 4.7 无水硫酸钠：650℃灼烧4h，冷却后储于密封容器中备用。 4.8 氨水+甲醇：25+75。量取25mL氨水（4.4），以甲醇（4.2）定容100mL，混匀。 4.9甲酸溶液：0.1%。移取1mL甲酸（4.5),以水定容1L。 4.10乙酸铵缓冲液：10mmol/L。称取0.77g乙酸铵（4.6），溶于约700mL水中，以甲酸调节 pH=4.6,以水定容1L。 4.11十五种喹诺酮类药物标准物质：氟罗沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、 洛美沙星、单诺沙星、奥比沙星、双氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、喹酸、萘啶酸、氟甲喹，纯度均≥98%。 4.12标准储备溶液：100mg/L。准确称取十五种喹诺酮类药物标准物质（4.11)各10.0mg，分别用 1 GB/T20751—2006 4.13标准工作溶液：根据需要取适量标准储备液（4.12），以甲酸溶液（4.9）十乙睛（4.1）（9十1）稀释成 适当浓度的混合标准工作溶液。标准工作溶液要现配现用。 4.14强阳离子交换柱（SCXSPE柱）或相当者：500mg，3mL。用前依次以3mL甲醇、3mL水，3mL 10mmol/L乙酸铵缓冲液（4.10）活化，保持柱体湿润。 4.150.22μm滤膜。 5仪器 5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.2 5.3 组织捣碎机。 5.4 旋涡振荡器。 5.5 分散器：转速应达到10000r/min。 5.6 超声波发生器。 5.7 氮气浓缩仪。 固相萃取装置。 5.8 5.9真空泵：真空度应达到80kPa。 5.10微量注射器：1mL~5mL,100μL~1000μL。 5.11离心机：转速应达到4000r/min。 6试样的制备与保存 6.1试样制备 鳗鱼去头，将皮、肉分离后先取鱼皮置于微波炉中，以中高功率加热30s后取出切成小块，将鱼肉 切成小块，将二者一并放入组织捣碎机均质，充分混匀，装人清洁容器内，并标明标记。 鳗鱼制品取可食部分切成小块，放入组织捣碎机均质，充分混匀，装人清洁容器内，并标明标记 制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2试样保存 试样于一18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2℃～6℃贮存72h。 7测定步骤 7.1提取 称取5g试样（精确至0.01g）置于50mL聚丙烯离心管中，加入约5g无水硫酸钠（4.7），25ml 乙腈，使用分散器（5.5），在10000r/min分散提取30s，4000r/min离心（5.11）5min，上清液转移至 50mL比色管中，另取一50mL离心管加入15mL乙，洗涤分散刀头10s，洗涤液移入第一支离心管 中，用玻棒搅动残渣，旋涡振荡（5.4）提取1min，超声波振荡（5.6）提取5min，4000r/min离心5min， 上清液合并至50mL比色管，残渣再加入15mL乙睛，旋涡振荡提取1min，4000r/min离心5min， 上清液合并至50mL比色管，乙定容至50.0mL。摇匀后移取10.0mL乙提取液，以2×5mL正 已烷（4.3）振摇脱脂，使用氮气浓缩仪（5.7)在35℃下氮吹至近干，加入3mL乙酸铵缓冲液（4.10），旋 涡振荡30s,待净化 7.2净化 将7.1所得的溶液以约1mL/min的流速全部通过强阳离子交换柱（4.14），抽干，先后以1.5mL 甲醇、3mL氨水十甲醇（4.8）洗脱，合并洗脱液，35℃下氮吹至近干，以甲酸溶液（4.9）十乙腈（4.1） （9十1）定容至1mL，过0.22um滤膜（4.15），供液相色谱-串联质谱分析 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g（精确至0.01g），按7.1和7.2操作。 2 GB/T20751—2006 7. 4 测定 7. 4. 1 液相色谱条件 a) 色谱柱：Cis，5μm，150mmX2.1mm或相当者； b) 柱温：30℃； c) 流速：200μL/min; d) 进样量：20L； e) 梯度洗脱，洗脱程序见表1。 表 1 液相色谱梯度洗脱程序 时间/min 流速/(μL/min) 乙腈/(%) 甲醇/（%) 0.1%甲酸/（%） 0 300 2 20 78 4. 00 300 5 20 75 8.00 300 10 20 70 10.00 300 40 20 40 15.00 008 40 20 40 15.50 300 2 20 78 22.00 300 2 20 78 7. 4. 2 质谱条件 a) 离子源：电喷雾源ESI； b) 扫描方式：多反应监测（MRM），正离子模式； c) 离子源温度：490℃； d) 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流 量以使质谱灵敏度达到检测要求； e) 喷雾电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度； f) 定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞气能量见表2。 表 2 2十五种喹诺酮类药物的质谱参数 定性离子对 定量离子对 药物名称 英文名称 碰撞气能量/V 碰撞池出口电压/V (m/z) (m/ z) 370.4/326.4 30 70 氟罗沙星 fleroxacin 370.4/326.4 370.4/269.4 40 70 362.4/318.4 30 60 氧氟沙星 ofloxacin 362.4/318.4 362.4/261.3 40 60 321.1/303.4 35 70 依诺沙星 enoxacin 321.1/303.4 321.1/232.2 48 70 320.4/276.6 26 50 诺氟沙星 norfloxacin 320.4/276.6 320.4/233.2 30 50 332.4/288.3 25 60 环丙沙星 ciprofloxacin 332.4/288.3 332.4/245.3 33 60 360.6/316.4 30 60 恩诺沙星 enrofloxacin 360.6/316.4 360.6/245.4 40 60 352.3/308.4 28 60 洛美沙星 lomefloxacin 352.3/308.4 352.3/265.4 33 60 3