ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T207612006 牛尿中α-群勃龙、B-群勃龙、19-乙烯去甲睾 酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of aα-trenbolone, β-trenbolone,nortestosterone and epi-nortestosterone residues in bovine urine- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20761—2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验 检疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、王凤风池、郭春海、艾连峰， 本标准系首次发布的国家标准。 1 GB/T20761—2006 牛尿中α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和 epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛尿中α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的液相 色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于牛尿中α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定。 本标准的方法检出限：牛尿中α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮均为 2 μg/ L。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T 6379.1—2004,ISO 5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2:1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 试样在pH=5.0条件下加酶水解，经免疫亲和柱净化，用液相色谱-串联质谱测定，外标法定量 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3乙酸：色谱纯。 4.4β-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯（β-glucuronidaseandaryl sulfatase)：100000unit/mL。 4.5 氢氧化钠溶液：1mol/L。10g氢氧化钠溶于250mL水中。 盐酸溶液：1mol/L。吸取20.8mL浓盐酸溶于水中，定容至250mL。 4.6 4.7 免疫亲和柱淋洗缓冲储备液和柱贮存缓冲储备液：免疫亲和柱附带。 4.8柱淋洗缓冲溶液：量取1mL储备溶液与19mL水混溶，临用前现配。 4.9柱贮存缓冲溶液：量取1mL储备溶液与4mL水混溶，临用前现配。 4.10甲醇+水溶液：70+30。 4.11α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮标准物质：纯度≥98%。 4.12标准储备溶液：分别精确称取α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲罩酮和epi-19-乙烯去甲罩酮标准 物质（4.11)各0.0100g，用乙睛（4.2）溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的标准储备溶液。此 GB/T 20761—2006 溶液一18℃冷冻保存，可使用六个月。 4.13混合标准工作溶液：取标准储备溶液（4.12）各5mL置于50mL容量瓶中，用乙睛定容至刻度， 配制成混合标准工作溶液，浓度为10ug/mL，此溶液一18℃冷冻保存，可使用三个月。 4.14群勃龙/19-乙烯去甲睾酮免疫亲和柱：带有柱淋洗缓冲储备溶液和柱储存缓冲储备溶液，在 2℃~8℃保存。 4.150.45μm滤膜。 5仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2离心机：最大转速5000r/min。 5.3恒温水浴摇床。 5.4旋涡混合器。 5.5氮气浓缩仪。 5.6固相萃取装置。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 取新鲜牛尿迅速冷冻作为试样备用。 6.2试样保存 制备好的试样置于一18℃冰柜中避光保存。 7测定步骤 7.1基质混合标准校准溶液的制备 7.1.1试样的称取 取5个阴性样品，将冷冻尿液融化混匀，取部分样品以转速4000r/min离心10min。然后，每个 样品分别量取5mL（精确到0.01mL）于15mL具塞离心管中，再分别加入不同量混合标准工作溶液 （4.13），使各被测组分的浓度均为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。 7.1.2水解 分别将上述离心管溶液，用1mol/L的盐酸（4.6）调节尿样pH值在4.9～5.1之间，接着加入 40μLβ-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯（4.4），摇勾后盖好塞子置于恒温水浴摇床（5.3）上37℃振荡水解 2h。待水解液冷却至室温后，加人4mL柱淋洗缓冲溶液（4.8）,用1mol/L氢氧化钠溶液（4.5）调整尿 样pH值在7~9之间。 7.1.3免疫亲和柱净化 首先将柱贮存缓冲溶液（4.9)过柱，再用15mL柱淋洗缓冲溶液平衡柱子。然后，将水解处理好的 尿样过柱，接着依次用8mL柱淋洗缓冲溶液、5mL水淋洗柱子。最后，用4mL甲醇十水溶液（4.10） 洗脱分析物并收集于带刻度的试管中（上述过程过柱流速应≤2mL/min）。洗脱液用氮气浓缩仪（5.5） 在60℃水浴中吹至约1mL，用流动相定容至2mL，旋涡振荡（5.4）混合，过0.45um滤膜（4.15）供 LC-MS-MS 测定。 注：为确保柱子在下次使用时无残留影响，应继续用10mL甲醇十水溶液（70+30）洗涤柱子。若接着使用此柱， 则重复7.1.3步骤。若不再使用，应用15mL柱贮存缓冲溶液洗涤柱子，最后柱内保留5mL柱贮存缓冲溶 液，2℃～8℃保存。此柱能重复使用10次左右。 7.2试样溶液的制备 将冷冻尿液样品融化混匀，取部分样品以转速4000r/min离心10min。然后，量取5mL（精确到 2 GB/T20761—2006 0.01mL)于15mL具塞离心管中。按7.1.2和7.1.3操作。 7.3空白基质溶液的制备 将阴性冷冻尿液样品融化混匀，取部分样品以转速4000r/min离心10min。然后，量取5mL（精 确到0.01mL)于15mL具塞离心管中。按7.1.2和7.1.3操作。 7.4测定 7.4.1 液相色谱条件 a) 色谱柱：InertsilCis，5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； b) 流动相：0.1%乙酸水溶液十乙（62十38）； c) 流速：0.3mL/min； d) 色谱柱温度：35℃； 进样量：20μL。 e) 7. 4.2 质谱条件 a) 离子源：ESI,正模式； b) 雾化喷嘴压力：0.24MPa； c) 干燥气流量：9.0L/min； d) 干燥气温度：350℃； e) 毛细管电压、去簇电压、碰撞电压等电压值应优化至最优灵敏度； f) 检测离子对见表1。 表1 四种被测物的保留时间、母离子和子离子 被测物 保留时间/min 母离子(m/) 子离子(m/2) β-群勃龙 6.5 271 253" 199 α-群勃龙 7. 2 271 253* 199 19-乙烯去甲翠酮 8.4 275 257 239 epi-19-乙烯去甲睾酮 11. 4 275 257 239 a定量离子。 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间， 与基质混合标准校准溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对 丰度与浓度接近的基质混合标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过 表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大充许误差 % 相对离子丰度 >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的相对误差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下，对基质混合标准校准溶液进样，以峰面积为纵坐标，基质混合校准溶液浓 度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪 器测定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下，标准品选择离子质量色谱图参见图A.1。 本标准的添加回收率数据参见附录B。本标准的添加回收率数据参见附录B。 7.5平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 3