ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 20752—2006 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中 硝基喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination residues of the metabolites of nitrofuran in pork, beef, chicken, porcine liver and aquatic products- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20752—2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、张进杰、曹彦忠、郭彤彤、曹亚平、范春林、李学民、刘永明 本标准系首次发布的国家标准 GB/T20752—2006 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中 硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品（鱼类、虾蟹类和贝类）中喃它酮（furaltadone）的代 谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮（3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone，缩写为 AMOZ），味喃西林（nitrofurazone）的代谢物氨基脉（semicarbazide，缩写为SEM）、呋喃妥因（nitro- furantoin）的代谢物1-氨基-2-内酰脲（1-aminohydantoin，缩写为AHD）和呋喃唑酮（furazolidone）的代 谢物3-氨基-2-唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone，缩写为AOZ）残留量液相色谱-串联质谱测定 方法。 本标准适用于猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品（鱼类、虾蟹类和贝类）中5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑 烷基酮、氨基脲、1-氨基-2-内酰脲、3-氨基-2-唑烷基酮残留量的测定。 本标准方法的检出限：5-吗啉甲基-3-氨基-2-嗯唑烷基酮、氨基脲、1-氨基-2-内酰脲、3-氨基-2-嗯唑 烷基酮的检出限均为0.5 μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2:1994，IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 试样中残留的硝基哺类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化,用OasisHLB或性能相当 的固相萃取柱净化。电喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测。用外标法或同位素标记的内标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3乙酸乙酯：色谱纯 4.4磷酸氢二钾,K,HPO4。 4.5乙酸。 4.6二甲亚砜。 4.7盐酸。 GB/T 20752—2006 4.8氢氧化钠。 4.92-硝基苯甲醛（2-NBA）,C,H,NO3：含量≥99%。 4.10磷酸氢二钾溶液：0.1mol/L。称取17.4g磷酸氢二钾（4.4），用水溶解，定容至1000mL。 4.11盐酸溶液：0.2mol/L。量取17mL浓盐酸（4.7)用水定容至1000mL。 4.12氢氧化钠溶液：1mol/L。称取40g氢氧化钠（4.8）,用水溶解，定容至1000mL。 4.13衍生剂：含2-硝基苯甲醛0.05mol/L。称取0.075g2-硝基苯甲醛（4.9)溶于10mL二甲亚砜 （4.6），现用现配。 4.14样品定容溶液：10mL乙睛（4.2），0.3mL乙酸（4.5），用水稀释到100mL。 4.15四种硝基呋喃代谢物标准物质：呋喃它酮的代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮（3-amino-5- morpholinomethyl-2-oxazolidinone，缩写为AMOZ）、呋喃西林的代谢物氨基脲（semicarbazide，缩写为 SEM）、呋喃妥因的代谢物1-氨基-2-内酰脲（1-aminohydantoin，缩写为AHD）和呋喃唑酮的代谢物 3-氨基-2-唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone，缩写为AOz）标准物质，四种标准物质的纯度均 ≥99%。 4.16四种硝基呋喃代谢物内标标准物质：5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮的内标物,Ds-AMOZ；氨 基脲的内标物，13C15N-SEM1-氨基-2-内酰脲的内标物，13C3-AHD;3-氨基-2-唑烷基酮的内标物， D-AOZ。四种内标标准物质的纯度均≥99%。 4.17四种硝基呋喃代谢物标准储备溶液：1.0mg/mL。称取适量的四种硝基呋喃代谢物标准物质 （4.15），分别用甲醇（4.1）稀释成1.0mg/mL的标准储备液。避光保存于一18℃冰柜中，可使用六 个月。 4.18四种硝基呋喃代谢物混合标准溶液：0.1ug/mL。吸取适量四种硝基喃代谢物的标准储备溶 4.19四种硝基喃代谢物内标标准储备溶液：1.0mg/mL。称取适量的四种硝基呋喃代谢物内标标 准物质（4.16），分别用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液。避光保存于一18℃冰柜中，可使用六个月。 4.20四种硝基呋喃代谢物内标标准溶液：0.1ug/mL。移取适量的四种硝基呋喃代谢物内标标准储 备溶液（4.19），用甲醇稀释成0.1μg/mL的混合内标标准溶液，避光保存于一18℃冰柜中，可使用三 个月。 4.21OasisHLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理， 保持柱体湿润。 4.220.2μm滤膜。 5仪器 5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g各一台。 5.3 液体混匀器 5.4 固相萃取装置。 5.5 氮气吹干仪。 5.6 恒温振荡水浴。 5.7 真空泵：真空度应达到80kPa。 5.8 微量注射器：25μL，100μL。 5.9 棕色具塞离心管：25mL，50mL。 5.10pH计：测量精度士0.02pH单位。 5.11 贮液器：50mL。 5.12 离心机：转速4000r/min以上。 2 GB/T20752—2006 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 实验室样品用组织捣碎机绞碎，分出0.5kg作为试样 6.2试样保存 试样置于一18℃冰柜，避光保存。 7测定步骤 7.1混合基质标准校准溶液的制备 7.1.1样品称取和脱脂 称取5个阴性样品2g（精确到0.01g），分别置于50mL棕色离心管（5.9)中，加入10mL甲醇-水 混合溶液（2十1），均质1min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000r/min离心 5min，吸取上清液弃掉。向5个离心管中分别加人适量四种硝基呋代谢物混合标准溶液（4.18），使 四种硝基呋喃代谢物最终测定浓度分别为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、 10.0ng/mL。再向每个离心管中加入适量混合内标标准溶液（4.20），使四种硝基呋喃代谢物内标物最 终测定浓度均为2.0ng/mL。 7.1.2水解和衍生化 向上述每个离心管中加人10mL0.2mol/L盐酸溶液（4.11)均质1min，用10mL0.2mol/L盐酸 溶液洗涤均质器刀头，二者合并后加入0.3mL衍生剂（4.13），用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡 水浴（5.6)中避光反应16h。 7.1.3净化 上述衍生溶液放置至室温后，加人5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（4.10），用1mol/L氢氧化钠 溶液（4.12)调节溶液pH约为7.4，4000r/min离心10min，上清液（若待测样品含脂肪较多，上清液加 5mL正已烷，振荡2min，4000r/min离心10min吸取并弃掉正已烷）倒人下接OasisHLB固相萃取 柱（4.21)的贮液器（5.11)中，在固相萃取装置（5.4)上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB 65kPa负压下抽干OasisHLB固相萃取柱15min。用5mL乙酸乙酯（4.3）洗脱被测物于25mL棕色 离心管中，使用氮气吹干仪（5.5），在40℃水浴中吹干，用样品定容溶液（4.14）溶解并定容至1.0mL， 混匀后过0.2um滤膜（4.22)用液相色谱-串联质谱测定。 7.2待测样品溶液的制备 称取待测样品2g（精确到0.01g），置于50mL棕色具塞离心管（5.9)中，加人10mL甲醇-水混合 溶液（2十1），均质1min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000r/min离心 5min