ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T20753—2006 牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮 和醋酸甲地孕酮残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 Method for the determination of melengestrol acetate,chlormadinone acetate and megestrol acetate residues in bovine and porcine fat- LC-UV Detection Method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20753—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、唐毅锋、方晓明、干传现、姜维 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T20753—2006 牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮 和醋酸甲地孕酮残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 1范围 本标准规定了牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的液相色谱测定 方法。 本标准适用于牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的测定。 本标准的方法检出限：醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮均为0.010mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T 6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 脂肪样品经微波融化，用乙腈提取，皂化后，经氰丙基型固相萃取柱净化，C1色谱柱分离，紫外检 测，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙腈：色谱纯。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙酸乙酯：色谱纯。 4.4正已烷：色谱纯。 4.5 氯化镁（MgClz·6H20)。 4.6 氢氧化钠。 4.7 盐酸。 4. 8 乙酸乙酯十正已烷（1十19）：量取10mL乙酸乙酯（4.3）与190mL正已烷（4.4）混合。 4.9 乙酸乙酯十正已烷（1十4）：量取40mL乙酸乙酯（4.3）与160mL正已烷（4.4）混合。 4. 10 盐酸溶液：0.2%。移取2.0mL盐酸（4.7)与水混合至1L。 4.11 氯化镁溶液：1.0mol/L。称取20.3g氯化镁（4.5），用水溶解并定容到100mL。 4. 12 氢氧化钠溶液：0.1mol/L。称取1.00g氢氧化钠（4.6）,用水溶解并定容到250mL。 4. 13 乙+水（65+35）：量取650mL乙腈（4.1）与350mL水混合，摇匀，脱气，待用。 1 GB/T 20753—2006 4.14标准物质：醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮，纯度≥97%。 4.15标准储备溶液：1000μg/mL。准确称取醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮（4.14)标 准物质各0.0500g于50mL容量瓶中，用甲醇（4.2）溶解并定容至刻度。标准储备溶液于4℃保存，可 使用1年。 4.16混合标准溶液I：100μg/mL。分别吸取10.0mL醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮 标准储备液（4.15）于100mL容量瓶中，用甲醇定容。该混合标准溶液于4℃保存，可使用1年。 4.17混合标准溶液Ⅱ：1.0μg/mL。取1.0mL混合标准溶液I(4.16）于100mL容量瓶中，用甲醇定 容。该混合标准溶液于4℃保存，可使用6个月。 4.18混合标准工作溶液：分别吸取10μL，20μL,40μL，80μL，100μL混合标准溶液Ⅱ（4.17)添加到 980μL，970μL，950μ，910μL，890μL的乙腈+水（65+35）（4.13）中，再加10μ盐酸溶液 （4.10），混匀，得到浓度为0.010μg/mL、0.020μg/mL、0.040μg/mL、0.080μg/mL和0.10μg/mL混 合标准工作溶液，该溶液当日制备 4.19氰丙基固相萃取柱或相当者：3mlL,500mg。使用前分别用5mL乙酸乙酯和6mL正已烷淋 洗，保持柱体湿润。 4.20滤膜：0.2um。 5仪器 SZIG 5.1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3 氮气浓缩仪 5.4 固相萃取装置：配有真空泵。 5.5 低温离心机：一5℃至室温，最大转速5000r/min。 5.6液体混匀器。 5.7恒温水浴。 5.8微波炉。 5.9移液器:10μL~100μL和100μL~1000μL。 6试样的制备与保存 6.1试样制备 把大约5g的猪或牛脂肪组织切成小块，然后放人底部塞有玻璃棉的漏斗中，将漏斗放入150mL 的烧杯中，将烧杯置于微波炉内。使用最大功率，加热30s～60S，如果脂肪没有融化，可在间隔30s～ 60s以后重复加热30s～60s，直到有液体脂肪流出，通过漏斗滴入烧杯中。根据需要熬制的脂肪量， 可重复加热。把熬制好的脂肪油放人样品瓶中，密封，并做上标记。 6.2试样保存 如果熬制好的脂肪液体不立刻测定，则将熬制好的脂肪样品置于一18℃冰柜中，冷冻保存。 7测定步骤 7.1提取 称取2g脂肪样品，精确到0.01g，置于50mL具塞离心管中，加入5mL乙，于60℃水浴中保持 3min，使固体脂肪融化。用液体混匀器（5.6）涡旋1min，于一5℃以3500r/min离心7min，吸取上清 液至15mL具塞聚内烯离心管中，再向沉淀物中加入5mL乙睛重复提取一次，合并上清液。向合并的 乙睛提取液中加入2mL正已烷，涡旋1min，于一5℃以3500r/min离心5min，弃去正已烷层，乙睛相 再用2mL正已烷重复洗涤一次，弃去正已烷层。乙睛提取液于60℃用氮气浓缩仪吹干。 2 GB/T20753—2006 7.2皂化 （4.11），于液体混匀器上快速混匀10s，在60℃水浴中保持15min，于一5℃以3500r/min离心5min， 吸取上清液至15mL玻璃离心管中。向沉淀物中再加人4mL正已烷，混匀，于60℃水浴中加热 15min后，于一5℃以3500r/min离心5min，合并上清液。于60℃用氮气浓缩仪吹干，用1.0mL正 已烷溶解残渣，待净化 7.3净化 将上述样液（7.2)移入氰丙基固相萃取柱中（4.19）用2mL正已烷分两次润洗玻璃试管，洗液也 移入固相萃取柱中。待样液流出后，依次用5mL正已烷和6mL乙酸乙酯十正已烷溶液（4.8）淋洗固 相萃取柱，淋洗液流出后，固相萃取柱抽干2min，最后用3.5mL乙酸乙酯十正已烷溶液（4.9）洗脱，洗 脱液收集于另一15mL玻璃离心管中，于60℃用氮气浓缩仪吹干。残余物用990uL乙睛十水（4.13） 涡旋溶解，静止15min后，加入10μL盐酸溶液（4.10），混匀，过0.2μm滤膜后，供液相色谱测定。 7.4测定 7.4.1 液相色谱条件 色谱柱：KromasilCis，5μm，250mmX4.6mm（内径）或相当者； 预柱：Cis,5μm,12.5mmX4.6mm(内径); c) 流动相：乙睛+水（65+35）； 流速：1.0mL/min; 柱温：35℃； e) f) 检测波长：292nm； 进样量：40μL。 7.4.2液相色谱测定 用混合标准工作溶液（4.18)分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标 准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕 酮的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲 地孕酮标准物质的液相色谱图参见图A.1。 SAG 7.5平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 7.6回收率试验 阴性样品中添加标准溶液，按7.1～7.3操作，测定后计算样品添加的回收率。 8结果计算 结果按式(1)计算： Vx1000 X0=X ...(1) 1000 式中： X-—试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V—一试样溶液定容体积，单位为毫升（mL)； m—最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克（g）。 9精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值 3