ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T207552006 畜禽肉中九种青霉素类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of nine penicillins residues in livestork and poultry muscles- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20755—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、李学民、张进杰、曹彦忠、刘晓茂、范春林、刘永明、赵为 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T20755—2006 畜禽肉中九种青霉素类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛，羊、猪和鸡肉中九种青霉素类药物残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于牛、羊、猪和鸡肉中九种青霉素类药物残留量的测定。 本标准的方法检出限：萘夫西林为0.25μg/kg，青霉素G为0.5ug/kg，哌拉西林、青霉素V、苯唑 西林为1.0μg/kg，阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、双氯西林为2.0μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004ISO5725-2:1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO.3696：1987） 3原理 试样中青霉素类药物残留，用0.15mol/L磷酸二氢钠（pH=8.5)缓冲溶液提取，经离心，上清液用 固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3磷酸二氢钠(NaH,PO,）。 4.4、氢氧化钠。 4.5乙酸。 4.6 乙十水（1+1）：量取50mL乙腈（4.2）与50mL水混合。 4.7 氢氧化钠溶液：5mol/L。称取20g氢氧化钠（4.4），用水溶解，定容至100mL。 4.8 磷酸二氢钠缓冲溶液：0.15mol/L。称取18.0g磷酸二氢钠（4.3），用水溶解，定容至1000mL， 然后用氢氧化钠溶液（4.7)调节至pH一8.5。 4.9阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、双氯西林九 种青霉素标准物质：纯度≥99%。 4.10九种青霉素标准储备溶液：准确称取适量的每种标准物质（4.9），分别用水配制成浓度为 1.0mg/mL的标准储备溶液。储备液贮存在一18℃冰柜中。 4.11九种青霉素标准工作溶液：根据需要吸取适量的每种青霉素标准储备溶液（4.10）用空白样品提 GB/T 20755—2006 取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液。 4. 12 2BUNDELUTCis固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇（4.1）、5mL 水和10mL磷酸二氢钠缓冲溶液（4.8）预处理，保持柱体湿润。 4. 13 30.2μm滤膜。 5仪器 5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 5. 2 分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5. 3 振荡器。 5.4 固相萃取真空装置。 5.5 贮液器：50mL。 5.6 微量注射器：25μL，100μL。 5.7 刻度样品管：5mL，精度为0.1mL。 5. 8 离心机：带有50mL具塞离心管。 5. 9 pH计：测量精度0.02pH单位。 6测定步骤 6. 1 试样溶液的制备 称取3g试样（精确到0.01g)置于离心机（5.8)中，加入25mL磷酸二氢钠缓冲溶液（4.8），于振荡 器上振荡10min，然后，以4000r/min离心10min，把上层提取液移至下接BUNDELUTCi：固相萃取 3mL乙腈+水（4.6）洗脱，收集洗脱液于刻度样品管（5.7）中，用乙腈十水定容至3mL，摇匀后，过 0.2μm滤膜（4.13），供液相色谱-串联质谱仪测定。按照上述操作步骤制备空白样品提取液。 6.2测定 6.2.1 液相色谱条件 a) 色谱柱：SunFireTMCis，3.5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； b) 流动相梯度程序及流速见表1； 柱温：30℃； c) (p 进样量：20L。 表1沃 流动相梯度程序及流速 时间/ 流速/ 水（含0.3%乙酸）/ 乙晴（含0.3%乙酸）/ min (μL/min) (%) (%) 0.00 200 95. 0 5.0 3.00 200 95. 0 5. 0 3.01 200 50.0 50.0 13.00 200 50.0 50.0 13. 01 200 25.0 75.0 18.00 200 25.0 75.0 18. 01 200 95.0 5.0 25.00 200 95.0 5.0 2 GB/T20755—2006 6.2. 2 质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测； d) 电喷雾电压：5500V e) 雾化气压力：0.055MPa； f) 气帘气压力：0.079MPa； 辅助气流速：6L/min； g) h) 离子源温度：400℃； i) 定性离子对定量离子对和去簇电压（DP）聚焦电压（FP）、碰撞气能量（CE）及碰撞室出口电 压（CXP)见表2。 表 2 九种青霉素的定性离子对、定量离子对、去簇电压、聚焦电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压 定性 定量 碰撞气 去簇 聚焦 碰撞室 名称 离子对 离子对 能量/ 电压/ 电压/ 出口电压/ (m/2) (m/2) V V V V 阿莫西林 366/114 30 366/208 21 90 10 amoxicillin 366/208 19 氨芋西林 350/192 23 350/160 20 90 10 350/160 ampicillin 20 哌嗪西林 518/160 35 27 518/143 90 10 piperacillin 518/143 35 25 青霉素 G 335/160 20 335/160 23 90 10 penicillin G 335/176 20 青霉素V 351/160 20 351/160 40 90 10 penicillin V 351/192 15 苯唑西林 402/160 20 402/160 23 90 10 oxacillin 402/243 20 氯唑西林 436/160 21 436/160 20 90 10 cloxacillin 436/277 22 萘夫西林 415/199 23 415/199 23 06 10 nafcillin 415/171 52 双氯西林 470/160 20 470/160 20 90 10 dicloxacillin 470/311 22 6.2.3液相色谱-串联质谱测定 6.2.3.1定性测定 选择每种待测物质的一个母离子，二个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时 间与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在土2.5%之内；样品色谱图中各定性离子相对丰度与浓 度接近的基质标准溶液的色谱图中离子相对丰度相比，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品 中存在对应的待测物。 3