ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 20760—2006 牛肌肉、肝、肾中的α-群勃龙、β-群勃龙残 留量的测定 液相色谱-紫外检测法和 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of α-trenbolone, β-trenbolone residues in bovine muscle, liver and kidney- LC-UV method and LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20760—2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、郭春海、干凤池、艾连峰， 本标准系首次发布的国家标准。 1 GB/T20760—2006 牛肌肉、肝、肾中的α-群勃龙、β-群勃龙残留量的测定 液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛肌肉、肝、肾中α-群勃龙、β-群勃龙残留量的液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联 质谱测定方法。 本标准适用于牛肌肉、肝、肾中α-群勃龙、β-群勃龙残留量的测定 本标准的方法检出限：α-群勃龙、β-群勃龙的液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法的检出 限均为2μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2一2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987) 3原理 试样在pH=5.0条件下加酶水解，用乙酸乙酯提取群勃龙残留，经凝胶色谱净化仪（GPC)和硅胶 柱净化，用配有紫外检测器的液相色谱仪或用液相色谱-串联质谱测定，外标法定量 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙酸：色谱纯。 4.3乙腈：色谱纯。 4.4，乙酸乙酯。 4.5环已烷。 4.6丙酮。 4.7正已烷。 4.8β-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯（β-glucuronidaseandarylsulfatase)：100000unit/mL。 4.9乙酸乙酯+环已烷：50+50。 4. 10 0丙酮+正已烷：10+90。 4. 11P 丙酮+正已烷：30+70。 4.12乙酸钠缓冲液：0.02mol/L，pH=5.0。称取无水乙酸钠0.82g溶于500mL水中，用乙酸调节 pH=5.0。 1 GB/T20760—2006 4.13α-群勃龙、β-群勃龙标准物质：纯度≥98%。 4.14标准储备溶液：分别精确称取α-群勃龙、β-群勃龙标准物质（4.13）各0.0100g，用乙睛（4.3）溶 解并定容至100mL，配制成100μg/mL的标准储备溶液。此溶液一18℃冷冻保存，可使用六个月。 4.15混合标准工作溶液：取标准储备溶液（4.14）各5mL至50mL容量瓶中，用乙睛定容至刻度，配 制成混合标准工作溶液，浓度为10μg/mL，此溶液一18℃冷冻保存，可使用三个月。 4.16硅胶固相萃取柱：500mg，3mL；使用前用5mL丙酮十正已烷（4.10）预处理，保持柱体湿润。 4.170.45μm滤膜。 5仪器和设备 5. 1 液相色谱仪配有紫外检测器 5.2液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.3凝胶色谱仪 5.4均质器。 5.5旋转蒸发仪。 5.6 旋涡混合器。 5.7 离心机：最大转速5000r/min。 5.8氮气浓缩仪。 5.9恒温水浴摇床。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 牛肌肉、肝、肾组织用组织捣碎机绞碎，分出0.5kg作为试样备用。 6.2试样保存 制备好的试样置于一18℃冰柜中避光保存。 7测定步骤 7.1混合基质标准校准溶液的制备 7.1.1试样的称取 称取5个阴性样品，每个样品为5g（精确到0.01g），置于50mL具塞离心管中，再分别加人不同 量混合标准工作溶液（4.15），使各被测组分的浓度均为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、 100 ng/mL. 7.1.2提取 向上述盛有5个阴性样品的50mL具塞离心管中，加人5mL乙酸钠缓冲液（4.12）和20μLβ-葡 萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯（4.8），摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床（5.9）上，37℃振荡水解过夜 （≥5h）。待水解液冷却至室温后，加入20mL乙酸乙酯，在均质器（5.4）上以10000r/min的速度均质 提取1min后，3000r/min离心（5.7）10min，将上清液过滤至鸡心瓶中。再用20mL乙酸乙酯重复提 取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。 7.1.3净化 7.1.3. 1凝胶色谱仪(GPC)条件 b) 流动相：乙酸乙酯+环已烷（50+50），流速5.0mL/min； 2 GB/T20760—2006 c）定量环：5mL； d）净化程序：0min~10.5min弃去洗脱液，10.5min15.5min收集洗脱液，15.5min~18min 弃去洗脱液。 7.1.3.2GPC及硅胶固相萃取净化 将提取液在45℃下蒸至近干，用乙酸乙酯十环已烷（4.9)定容至10mL的玻璃试管中，按7.1.3.1 中GPC条件净化。净化后将收集的洗脱液蒸干，用3mL丙酮十正已烷（4.10）旋涡振荡（5.6）溶解残 渣，将溶液转移到预洗过的硅胶固相萃取柱（4.16）上的贮液器中，然后再用3mL丙酮十正已烷 （10十90）溶解一次，将合并的溶解液过硅胶固相萃取柱，接着用3mL内酮十正已烷（10十90）淋洗硅胶 柱，最后用5mL丙酮十正已烷（4.11）洗脱分析物并收集。洗脱液用氮气浓缩仪（5.8）在60℃水浴中吹 干，用1mL流动相旋涡振荡溶解，过0.45μm滤膜（4.17）供液相色谱-紫外检测和液相色谱-串联质谱 测定。 7.2试样溶液的制备 称取待测样品5g（精确到0.01g）于50mL带塞离心管中，按7.1.2和7.1.3操作。 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g（精确到0.01g）于50mL带塞离心管中，按7.1.2和7.1.3操作。 7.4液相色谱法测定 7.4. 1 液相色谱条件 a) 色谱柱：DiamonsilCis，5μm，150mmX4.6mm（内径）或相当者； b) 流动相：0.1%乙酸水溶液-乙腈-甲醇（50十20十30）； c) 流速：1.0mL/min; 检测波长：345nm； (p 柱温：40℃； e) f) 进样量：50μL。 7.4.2色谱测定 在仪器最佳工作条件下，对基质混合标准校准溶液进样，以峰面积为纵坐标，基质混合校准溶液浓 度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪 器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，β-群勃龙、α-群勃龙的保留时间分别约为11.2min和 13.4min。标准物质的液相色谱图参见图A.1。本方法的添加回收率数据参见表B.1。 7.5液相色谱-串联质谱法测定 7.5.1液相色谱条件 a)1 色谱柱：InertsilCis，5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； 流动相：0.1%乙酸水溶液十乙腈（62+38）； c) 流速：0.3mL/min； d) 色谱柱温度：35℃； e) 进样量：20μL。 7. 5.2 质谱条件 离子源ESI正模式； 雾化喷嘴压力：0.24MPa； c) 干燥气流量：9.0L/min； d) 干燥气温度：350℃； e) 毛细管电压、去集簇电压、碰撞电压等电压值应优化至最优灵敏度； f) 检测离子对见表1。 3