ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 20758—2006 牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、 孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of testosterone,epi-testosterone and progesterone residues in bovine liver and muscle tissues- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20758—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、林峰、林海丹、张美金、黄华军 本标准系首次发布的国家标准。 1 GB/T20758—2006 牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准适用于牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定。 本标准的方法检出限：肝脏中睾酮、表睾酮、孕酮为0.5ug/kg，肌肉中睾酮、表睾酮为0.1ug/kg， 孕酮为0.5μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T 6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 萃取柱净化，肝脏样品需再经硅胶固相萃取柱净化，洗脱液浓缩定容后，供液相色谱-串联质谱测定。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙腈：色谱纯。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3叔丁基甲醚：色谱纯。 4.4正已烷：色谱纯。 4.5三氯甲烷。 4.6甲酸铵。 4.7 β-葡糖苷酸酶和硫酸酯酶：H-2型,helixpomatia。 4.8磷酸盐缓冲液:1.0mol/L。称取13.6g磷酸二氢钾溶于100ml水中，称取8.7g磷酸氢二钾溶 于50mL水中，分别取70mL磷酸二氢钾水溶液和28mL磷酸氢二钾水溶液，混勾后调节pH值为 5.0，置4℃中可保存1周。 SAC 4.9饱和氯化钠水溶液。 4.10水饱和乙酸乙酯。 质：纯度≥98%。 1 GB/T20758—2006 4.12标准储备溶液：100μg/mL。准确称取适量的罩酮、表睾酮、孕酮标准物质，用甲醇分别配制成 100μg/mL的标准储备溶液，一18℃贮存，可使用6个月。 4.13标准工作溶液：5μg/mL。分别吸取5mL睾酮、表睾酮、孕酮标准储备溶液（4.12）至100mL容 量瓶中，以甲醇稀释并定容，此标准工作溶液的浓度为5μg/mL。一18℃贮存，可使用6个月。 4.14混合标准工作溶液：50μg/L。分别吸取1.00mL睾酮、表睾酮、孕酮标准工作液（4.13)至100mL 容量瓶中，以甲醇稀释并定容，此混合工作溶液的浓度为50μg/L。一18℃贮存，可使用3个月。 4.15内标储备溶液：100μg/mL。准确称取适量的氙代睾酮（ds-睾酮）、氛代孕酮（dg-孕酮）标准品，用 甲醇分别配制成100μg/mL的内标储备溶液，一18℃贮存，可使用6个月。 4.16内标工作溶液：5μg/mL。分别吸取5mL氙代睾酮（d-睾酮）、氙代孕酮（d孕酮）内标储备溶液 （4.15）至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容。一18℃贮存，可使用6个月。 4.17内标混合工作溶液：25μg/L。分别吸取0.50mL氛代睾酮（ds-睾酮）、氛代孕酮（dg孕酮）内标 工作溶液（4.16）至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容。一18℃贮存，可使用3个月 液（4.14)和内标工作溶液（4.16），用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液。当天 配制。 4.19 Cis固相萃取柱：500mg，6mL。使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化。 4.20 硅胶固相萃取柱：200mg，6mL。使用前用6mL正已烷活化。 4.21滤膜：0.2μm。 5仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源。 分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.2 5.3 匀质机。 5.4 高速组织匀浆机。 5.5 低温高速离心机：转速大于4000r/min。 5.6 高速离心机：转速大于12000r/min。 5.7 超声波。 5.8 旋涡振荡器。 5.9 振荡水浴。 5. 10 氮气浓缩仪。 5. 11 固相萃取装置。 5. 12 2旋转蒸发器。 5. 13 KD浓缩瓶。 6试样制备与保存 6.1 试样的制备 取样品约500g用组织捣碎机捣碎，装人洁净容器作为试样，密封，并标明标记。 6.2试样的保存 将试样于-18℃保存。 7测定步骤 7.1酶解 准确称取5g试样，准确至0.01g，置于50mL离心管中，依次加人200μL内标混合工作溶液 2 GB/T20758—2006 （4.17）、10mL磷酸盐缓冲液（4.8）以14000r/min均质30s，加人60μL葡萄糖苷酸酶和硫酸酯酶 （4.7），混匀30s，置于37℃恒温振荡水浴中酶解16h。 7.2提取 酶解后的样品溶液（7.1)加10ml甲醇，混匀2min，置冰浴中放置5min，在5℃以4000r/min 离心10min，上清液转移至50mL离心管中，下层沉淀再用5mL甲醇重复上述操作一次，合并上清液 至上述50mL离心管中，向离心管中加人15mL叔丁基甲醚，振摇5min，以4000r/min离心5min， 上层溶液转移至125mL分液漏斗中，下层溶液依次再用15mL、10mL叔丁基甲醚提取两次，合并上 层溶液至上述分液漏斗中，加入10mL饱和氯化钠水溶液（4.9），振摇30，静置分层，上层溶液转移 至梨形瓶中，在40℃旋转蒸发至于，残渣中加人1.5mL甲醇，涡旋1min，超声5min，再加人20mL 水，混匀，待净化。 7.3净化 将样品提取液（7.2)转移至已活化的Cl固相萃取柱（4.19）上，用5mL水洗涤梨形瓶，洗涤液合并 至Cis固相萃取柱中，以≤2mL/min流速使样液通过固相萃取柱，待样液过柱后，用5mL水淋洗Crs 固相萃取柱，弃去淋洗液，用10mL甲醇将待测组分从Cis固相萃取柱上洗脱，洗脱液转移至梨形瓶中， 在40℃旋转蒸发至干。肌肉样品用0.5mL甲醇溶解残渣，涡旋1min，加入0.5mL水混匀，过 0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。 肝脏样品的洗脱液蒸干后，向梨形瓶中加入0.5mL三氯甲烷，涡旋1min，加人5mL正已烷，超 声1min，然后转移至已活化的硅胶固相萃取柱（4.20）中，以1mL/min流速使样液通过固相萃取柱， 待样液过柱后，用5mL正已烷淋洗硅胶固相萃取柱，弃去淋洗液，用6mL水饱和乙酸乙酯（4.10）洗 脱待测组分，洗脱液转移至KD接收瓶中，在40℃旋转蒸发至干，加0.5mL甲醇，涡旋1min,加人 0.5mL水混匀，过0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。 称取阴性样品，按7.1、7.2和7.3步骤制备空白样品提取液，用于配制系列基质混合标准工作 溶液。 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 a) 色谱柱：Cig色谱柱，5μm，150mmX2.1mm（内径）； 柱温：40℃； c) 进样量：20μL； (P 流动相、流速及梯度洗脱条件见表1。 表1流动相、流速及梯度洗脱条件 时间/min 流速/（mL/min） 乙腈/(%) 3mmol/L甲酸铵/（%） 0.00 0.200 30 70 10.00 0.200 85 15 15.00 0.200 85 15 15.01 0.200 30 70 23.01 0.200 30 70 7.4.2质谱条件 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描； 检测方式：多反应监测； 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流 (p 量以使质谱灵敏度达到检测要求； 3