ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 20766—2006 牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇 玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for determination of zearalanol, zearalanone, diethylstilbestrol, hexestrol and dienoestrol multi-residues in bovine and equine liver, kidney and muscle- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20766—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、许泓、林安清、古珑、何伟张曼 本标准系首次发布的国家标准。 1 GB/T20766—2006 牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、 玉米赤霉酮、已烯雌酚、己烷雌酚、 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留 量液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留 量的测定。 本标准的方法检出限：牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇，玉米赤霉酮和已烷雌酚为0.5ug/kg， 已烯雌酚和双烯雌酚为1.0ug/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2:1994.IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 试样中残留的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚用叔丁基甲基醚和乙酸盐缓 冲溶液加酶解剂分别提取，硅胶固相萃取柱净化后浓缩，用液相色谱-串联质谱仪测定，保留时间和离子 丰度比定性，内标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1叔丁基甲基醚：色谱纯。 4.2乙酸：优级纯。 4.3乙酸钠(CH,COONa·3HzO)。 4.4乙酸盐缓冲溶液：0.2mol/L，pH=5.2。称取2.72g乙酸（4.2）和12.95g乙酸钠（4.3)溶解于 800mL水中，用氢氧化钠溶液（4.6）调节pH值至5.2土0.1加水定容至1000mL。 4.5氢氧化钠：优级纯 4.6氢氧化钠溶液：3mol/L。称取120g氢氧化钠（4.5)溶于1000mL去离子水中。 4.7甲醇：色谱纯。 GB/T20766—2006 4.8 乙腈：色谱纯。 4.9乙酸乙酯：色谱纯。 4. 10 正已烷：色谱纯 4. 11 二氯甲烷：色谱纯。 4. 12 2溶解液：正已烷十二氯甲烷（60十40）。量取60mL正已烷（4.10）与40mL二氯甲烷（4.11) 混合。 4.13 淋洗液：乙酸乙酯+正己烷（6+94）。量取6mL乙酸乙酯（4.9）与94mL正已烷混合 4.14洗脱液：乙酸乙酯+正己烷（60+40）。量取60mL乙酸乙酯与40mL正已烷混合 4. 15 5β-葡糖苷酸酶：H-2型，含β-葡糖苷酸酶124400units/mL,硫酸酯酶3610units/mL。 4. 16 激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇（包括α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%），纯度 ≥97%；玉米赤霉酮，纯度≥97%；已烯雌酚，纯度≥99%；已烷雌酚，纯度≥98%；双烯雌酚，纯度 ≥98%。 4.17激素及代谢物标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、双烯雌酚和已 烷雌酚标准物质，用甲醇（4.7)配制成1.0mg/mL标准储备溶液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度 的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用三个月。 4.18内标标准物质：氛代玉米赤霉醇（包括α-玉米赤霉醇-4氛代和β-玉米赤霉醇-4氛代，各50%），纯 度≥99%；已烯雌酚-8氙代，纯度≥98%。 4.19内标标准溶液：准确称取适量玉米赤霉醇-4氛代和已烯雌酚-8氛代标准物质，用甲醇分别配制 成1.0mg/mL内标标准储备溶液。再以甲醇稀释成与5ng/mL玉米赤酶醇和已烯雌酚峰面积或峰高 相当浓度的混合内标标准工作溶液，保存于4C冰箱中，可使用三个月。 4 mL/min。 4.210.45μm滤膜。 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱联用仪：配有大气压化学电离源。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3自动固相萃取仪或固相萃取装置 5.4 高速均质器：转速大于10000r/min。 5.5氮气浓缩仪。 5.6 涡旋振荡器。 5.7离心机：转速大于3000r/min。 5.8pH计：测量精度±0.2pH单位。 5.9具塞试管：25mL,50mL。 5.10 微量注射器：25μL，100μL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 取有代表性样品500g，绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品盒中，密封，并 做上标记。 6.2试样保存 制备好的试样置于一18℃冰柜保存。 2 GB/T20766—2006 7测定步骤 7.1基质混合标准溶液的制备 7.1.1试样的称取 称取5个阴性样品，每个样品为5g（精确到0.01g），置于50mL离心管中，分别加人不同量混合 标准工作溶液（4.17），使玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和已烷雌酚的浓度为1.25ng/mL、2.5ng/mL、 5.0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL；已烯雌酚和双烯雌酚的浓度为2.5ng/mL、5.0ng/mL 10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分别加人适量内标标准溶液（4.19），使内标物浓度均为 10 ng/mL。 7.1.2提取 加人20mL叔丁基甲基醚（4.1)，在10000r/min转速下高速均质（5.4)1min。3000r/min离心 （5.7）5min，将上清液全部转移至另一50mL具塞试管（5.9中备用。离心管中的残渣置于通风橱中 挥发30min，加入15mL乙酸盐缓冲液（4.4），高速均质1min3000r/min离心5min，将上清液全部 转移至另一25mL具塞试管（5.9）中，并在氮气浓缩仪（5.5）上于40℃水浴中吹去残余叔丁基甲基醚 后，加人80μLβ-葡糖苷酸酶（4.15）混匀，于52℃烘箱中放置过夜。在此缓冲溶液中加人氢氧化钠溶 液（4.6)将溶液pH值调至7,加人10mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min离心2min。移取叔丁 基甲基醚层与前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮气浓缩仪上于40℃水浴中吹干。加人1mL溶解 液（4.12），涡旋30s溶解，待净化。 7.1.3净化 把样液转人硅胶固相萃取柱（4.20），流速为2mL/min，在样品试管中加入3mL淋洗液（4.13），混 合后过柱，流速为2mL/min，用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗，加人2mL空气以4mL/min 的速度吹过硅胶柱。用6mL洗脱液（4.14）洗脱，流速为2mL/min，加入2mL空气以6mL/min的速 度吹过硅胶柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮气浓缩仪上于40℃水浴中吹干，加入1mL流动相，涡旋 30s溶解。溶液经滤膜（4.21)过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。 7.2试样溶液的制备 称取待测样品5g（精确到0.01g）于50mL离心管中，加人内标标准工作溶液，使内标物含量均为 2. 0 μg/kg。按7. 1. 2 和7. 1. 3操作。 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g（精确到0.01g）于50mL棕色离心管中，按7.1.2和7.1.3操作。 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 色谱柱:ZORBAXEclipseSB-Cg，3.5μm，150mmX4.6mm或相当者； b) 柱温：25℃； S1G c) 流动相：乙腈十水（70十30）； d) 流速:1.0 mL/min; e) 进样量：50μL。 7.4.2质谱条件 a) 离子化方式：大气压化学电离； 扫描方式：负离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（MRM)； 离子源温度：325℃； e) 雾化气压力：0.1035MPa； f）气帘气压力：0.0690MPa；