ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21100—2007 动物源性饲料中骆驼源性成分 定性检测方法 PCR方法 Identification of Camelidae derived materials in animal- originated feedstuffsPCR method 2008-04-01实施 2007-10-24发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T21100—2007 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共 和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、徐宝梁、干晶、曹际娟、高宏伟、宗卉、黄文、袁飞、赵贵明。 本标准首次发布。 GB/T21100—2007 动物源性饲料中骆驼源性成分 定性检测方法PCR方法 1范围 为0.1%（质量分数）。 本标准适用于动物源性饲料中骆驼源性成分的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT) SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction;PCR 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA（deoxyribonucleosidea acid，脱氧核糖核酸）的方法。模板 别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP（de- oxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火 和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25个～30个扩增 循环，扩增倍数达到约10°。 4原理 利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，无水乙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行 5试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要求。 5.1骆驼源性成分检测用引物（对）序列为： F:5-AGCCTTCTCTTCAGTCGCACAC-3" R:5′-GCCCATGAAAGCTGTTGCT-3' 5.2TaqDNA聚合酶（Taq，Thermusaquaticu，水生栖热菌）。 5.3限制性内切酶：TaqI酶。 5.4dNTPs:dATP(deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphos 1 GB/T21100—2007 phate，脱氧胸苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）。 5.5琼脂糖：电泳纯。 5.6溴化乙锭。 5.7三氯甲烷。 5.8无水乙醇。 5.970%乙醇。 5.10DNA分子量标准品（100bp～600bp）（bp：basepair，碱基对）。 5.11裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05mol/LTris- 0.0lmol/LEDTA（pH8.0)(ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸)。 5.12TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）:10mmol/LTris-HCl（pH8.0),1mmol/LEDTA（pH 8.0)。 5.1310XPCR缓冲液:100mmol/LKCl,160mmol/L(NH,),SO4,20mmol/LMgSO4,200mmol/L Tris-HCl（pH8，8），1%TritonX-1oo（t-octylphenoxypolyethoxyethanol，辛基苯氧基聚乙氧乙醇）， 1mg/mLBSA(bovine serumalbumin，牛血清蛋白）。 5.14电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LTE缓冲液（pH8.0)20mL加蒸馏水至1000mL； 使用时10倍稀释。 5.15溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg/mL 5.16加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖水溶液。 5.17酶切缓冲液:10mmol/LTris-HCl (pH7.5),10mmol/LMgCl2,50mmol/LNaCl,0.1mg/mLBSA。 6仪器设备 6.1DNA热循环仪。 6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.3恒温水浴锅。 6.4 离心机：离心力12000g。 6.5 微量移液器（0.5μL~10μL,10μL~100μL,10μL~200μL,100μL~1000μL)。 6.6电泳仪。 6.7 紫外检测仪。 6.8 pH计。 6.9 天平：感量0.01g。 7试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用。 8检验步骤 8.1样品的总DNA提取 心5min，转移上清于洁净离心管中，加等体积酚，混匀；12000g离心5min，转移上清于洁净离心管 中，加等体积三氯甲烷十异戊醇（24+1），混匀；12000g离心5min，取上清液；加2倍体积冰预冷的无 水乙醇，一20℃沉淀1h；12000g离心5min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加人50μLTE，溶解 2 GB/T21100—2007 沉淀。 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 8.2DNA浓度和纯度的测定 取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm和280nm处的吸光值A26和A280。DNA的浓度按式（1)计算： c=AXNX50/1000 (I)... 式中： c——DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）； A——260nm处的吸光值； N——核酸稀释倍数。 当A260/A28o比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增。 8.3PCR 扩增 DNA聚合酶2U、模板DNA100ng土50ng。 一般反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。72℃ 延伸5min。4℃保存。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含骆驼源性成分的样品作阳性对照，用 已知不含骆驼源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。 8.4PCR扩增产物电泳检测 取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加人溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL， 制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μuL～8uLPCR扩增产物分别和适量 加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电 泳结果并记录。 8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测 如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。 反应体系（20μL)：TaqI酶2U,酶切缓冲液2μL,加入PCR扩增产物至总体积20μL。 酶切在65℃或37℃下进行，30min。酶切完成后电泳，方法见8.4。 9结果判断与表述 9.1PCR扩增产物电泳检测结果 阳性样品扩增产物为208bp（序列参考附录A）。 9.2限制性内切酶酶切电泳检测结果 扩增产物酶切片段大小为153bp和55bp。 9.3结果表述 PCR产物为阳性，同时酶切结果正确者判为含有骆驼源性成分，表述为检出骆驼源性成分； PCR产物为阴性者判为不含有骆驼源性成分，表述为未检出骆驼源性成分。 10检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193执行。 11废弃物处理 检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。