ICS 67.180.10 B 47 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T21167—2007 蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of nitrofuran metabolites residues in royal jelly- LC-MS/MS method 2007-10-31发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T21167—2007 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 本标准主要起草人：丁涛、徐锦忠、沈崇钰、吴斌、陈惠兰、赵增运、张扬、朱春、蒋原、陶宏锦。 GB/T21167—2007 蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了蜂王浆中呋喃它酮的代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-嗯唑烷基酮（简称AMOZ）、味喃 物3-氨基-2-嗯唑烷基酮（简称AOZ)残留量的液相色谱-串联质谱的测定。 本标准适用于蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 3方法提要 硝基喃类药物在动物体内迅速分解，其原位稳定性只有数小时，而其代谢物在动物体内容易和蛋 白组织结合，十分稳定。利用三氯乙酸溶液沉淀王浆中蛋白质后，邻硝基苯甲醛作为衍生化试剂避光衍 生化16h，乙酸乙酯提取浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。 4试剂和材料 4.1水：应符合GB/T6682规定的一级水。 4.2甲醇：HPLC级。 4.3Z 乙酸乙酯：HPLC级。 4.4 乙酸铵：HPLC级。 4.5 三氯乙酸：分析纯。 4.6 无水磷酸氢二钾：分析纯。 4.7 二甲基亚砜：分析纯。 4.8 邻硝基苯甲醛：分析纯。 4. 9 同位素内标：AHD-13C3，AMOZ-D5，AOZ-D4，SEM·HCI-（13C,15N2），100μg/mL， 纯度≥98% 4.10AOZ、SEM·HCI、AMOZ和AHD·HCI标准品：纯度≥98%。 4.11AOZ、SEM、AMOZ和AHD标准储备溶液：1mg/mL。准确称取适量的AOZ、SEM·HCI、 AMOZ和AHD·HCl标准品（4.10），用甲醇（4.2）配成1.0mg/mL的标准储备液。储备液贮存在 4℃冰箱中,1年有效。 4.12AOZ、SEM、AMOZ和AHD标准工作溶液：用流动相分别配成浓度为100ng/mL、10ng/mL标 准工作溶液，标准工作溶液在4℃保存，3个月有效。 4.13内标溶液：用流动相配制浓度为50ng/mL四种内标混合溶液，内标混合溶液在4℃保存，1年 有效。 1 GB/T21167—2007 4.14衍生化溶液：50mmol/L邻硝基苯甲醛。称取0.0378g的邻硝基苯甲醛（4.8）到50mL烧杯 中，加入5mL二甲基亚砜（4.7)溶解，现配。 4.15磷酸氢二钾缓冲液（1mol/L）：称取87.1g无水磷酸氢二钾（4.6），加入500mL水溶解。 4.16三氯乙酸溶液[25%（质量浓度）]：称取25g三氯乙酸溶解于100mL水中。 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪（串联四极杆）：配有电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量0.01g和0.1mg各一台。 5.3 旋转蒸发仪或相当者。 5.4水浴振荡器。 5.5旋涡混匀器。 5.6真空泵：真空度应达到80kPa。 5.7 离心机。 5.8 移液器：5mL，200μL。 5.9 离心管：50mL，具塞。 6试样的制备与保存 6.1试样制备 将实验室样品搅拌均匀，分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记 6.2试样保存 将试样于冷冻状态下保存（一18℃）。 7测定步骤 7.1提取 准确称取2.00g试样，置于50mL具塞离心管中，准确加入0.100mL四种标准内标混合溶液 （4.13）、2mL25%三氯乙酸溶液、3mL水，于液体混匀器上快速混合1min，室温下振荡60min。 2500r/min离心5min，转移上层清液于干净50mL玻璃离心管中，加人150μL邻硝基苯甲醛溶液， 37℃水浴振荡过夜（16h）。取出样品，冷却到室温后，加入4mL磷酸氢二钾缓冲溶液（4.15），调节样品 溶液pH7~7.5。加人10mL乙酸乙酯，混合30S，2500r/min离心5min，取上层乙酸乙酯溶液到 50mL玻璃试管中，再加入8mL乙酸乙酯，重复上述提取步骤，合并提取液，40℃水浴旋转蒸发干。用 甲醇水溶液（4十6)1.0mL定容，过0.45um的滤膜到进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.2标准溶液的衍生化 分别准确移取100ng/mL和10ng/mL四种标准混合溶液（4.12)0.20mL、0.10mL和0.050ml 到干净的50mL玻璃离心管中，准确加入0.100mL四种标准内标混合溶液（4.13）、0.5mL1mol/L HCl、150μL邻硝基苯甲醛溶液（4.14），于旋涡混匀器上快速混合30s,37℃水浴振荡过夜（16h）。按 照样品提取步骤处理（7.1)后，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 a){ 色谱柱：Cis，5μm，150mm×2.1mm（内径），或相当者； b) 流动相：甲醇（A）十0.5mmol/L乙酸铵水溶液（B）； 流速：0.25mL/min； d) 梯度洗脱程序：0min~6.0min20%~60%A,6min~8min60%A,8min~9min60%~ 80%A,9min~9.1min 80%~20%A,9.1min~10.5min 20%A; 2 SAC GB/T 21167—2007 柱温：室温； e) 进样量：25μL。 7. 3. 2 串联质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子化电离源（ESI），正离子监测； b) 扫描方式：选择离子检测（SRM）； c) 雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氨气； d) 喷雾电压、碰撞电压等电压值均优化至最佳灵敏度； e) 选择离子对见表1。 表1选择离子对 母离子 子离子 测定物质 (m/z) (m/z) 134.0* AOZ 236.0 104.0 240.0 AOZ-D4 134.0* 166.0 SEM 209.0 192.0 SEM- (13 C,15 N2) 212.0 168.0* 134a AHD 249.0 178 AHD-13 C3 252.0 134° 291* AMOZ 335.0 262 AMOZ-D5 340.0 296.04 a定量离子。 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 衍生化后的标准工作溶液（7.2）在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样.以标准与内标物峰面 积比值为纵坐标，工作溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进 行定量，样品溶液中标准的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，其相应的标准物 质、内标色谱图和串联质谱图参见图A.1和图A.2。 7.4空白试验 除不加人试样外，按上述步骤进行。 8结果计算 结果用色谱数据处理机或按式（1)计算样品中硝基喃代谢物的浓度，结果需扣除空白值： Ax.m. .(1) Cx A.m 式中： 样品中硝基呋喃代谢物的浓度，单位为微克每千克（μg/kg）； Cx Ax 样品中硝基呋喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值； 硝基呋喃代谢物标准的质量，单位为纳克（ng）； m. A. 标准品中硝基呋喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值； 样品质量，单位为克（g）。 m- 3