ICS 67.050 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21330—2007 动物源性食品中链霉素残留量测定方法 酶联免疫法 Method for the determination of streptomycin residues in aminal original food- Enzyme-linked immunosorbent assay 2007-10-31发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T21330—2007 前言 本标准的附录A、附录 B为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局 本标准主要起草人：施伟良、张晓峰、朱振江、黎昊雁、吴姗。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T21330—2007 动物源性食品中链霉素残留量测定方法 酶联免疫法 1范围 本标准规定了肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中链霉素残留量的酶联免疫测定方法 本标准适用于肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中链霉素残留量的测定 本标准的方法检出下限：肉类、内脏和水产品为50.0ug/kg；牛奶和奶粉为20.0μug/kg 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所 有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研 究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379（所有部分）测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 微孔板中包被有绵羊抗免IgG抗体，加人特异性抗体（免抗链霉素抗体）、酶标记链霉素、链霉素标 准品或样品提取液后，特异性抗体与包被的绵羊抗兔IgG抗体结合，同时游离链霉素和酶标记链霉素 竞争性的与特异性抗体结合。通过洗涤除去未结合的链霉素和酶标记链霉素，然后加人底物显色，用酶 标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中链霉素的含量 4试剂和材料 除去另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1链霉素检测试剂盒（组成参见附录A)。 4.2 三氯乙酸。 4.3 氯化钠。 4.4氯化钾。 4.5 磷酸二氢钾。 4. 6 磷酸氢二钠。 4.7 磷酸二氢钠。 4.8 吐温-80。 4. 9 3%三氯乙酸：称取3g三氯乙酸（4.2），用水定容至100mL。 4.10 0PBS缓冲液：8.5g氯化钠，1.15g磷酸氢二钠，0.27g磷酸二氢钠，用水定容至1L。 4.11SDB缓冲液：1.15g磷酸氢二钠,0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，30g氯化钠，0.5mL吐 温-80，用水定容至1L。 4.12正已烷 4.13链霉素标准物质：纯度大于等于98%。 4.14链霉素标准品溶液的配制：用灭菌水作为溶剂配制成25mg/mL的储存液，于一20℃条件下 保存。 1 GB/T21330—2007 5仪器 5.1酶标仪。 5.28道移液器：50μL~300μL 5.3单道移液器：5μL~50μL，100μL~1000μL和2mL~10mL。 5.4混合振荡器。 5. 5 离心机。 5. 6 5具塞试管：20mL50mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 对组织样品：从全部样品中取有代表性样品，混匀，用四分法缩分出不小于1000g试样，去除脂 肪、充分绞碎、混匀、分装、密封，并加以标识。 对牛奶和奶粉：从原始包装中取有代表性样品，充分混匀，用四分法缩分出不小于500g试样，装人 清洁密闭容器，加封后标明标记。 6.2试样的保存 将样品于一18℃～一20℃条件下保存。 7分析步骤 7.1提取 7.1.1组织 称取2.5g去脂肪均质样品，精确到0.1g，置于50mL具塞试管中，加人5mLPBS缓冲液（4.10） 振荡10min，加人10mL的3%三氯乙酸（4.9）涡旋10min，6000r/min离心15min。取3mL上清液 于干净试管中，再加人2mL正已烷（4.12）3000r/min离心10min，吸取150μL下层液体加950μl 的SDB(4.11)缓冲液，调节pH至7.5左右。最后稀释倍数为50。 7.1.2牛奶 牛奶样品先离心去脂肪，然后以SDB缓冲液（4.11)直接做10倍稀释；对于奶粉则可以先用与样品 质量相等的水进行稀释溶解，离心去脂，然后再以SDB缓冲液（4.11）做5倍稀释，调节pH至7.5左 右，最后稀释倍数为10。 7.2测定条件 7.2.1酶标仪测定条件 酶标仪测定波长为450nm。 7.2.2洗板条件 7.2.2.1人工洗涤次数5次以上，每次注水量为250μL。 7.2.2.2自动洗板可以预定5次周期。 7.2.3操作条件 所有操作应在室温下（20℃～24℃）进行，链霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（20℃～ 24℃）后方可使用。 7.3测定步骤) 7.3.1将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。 1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不 同，需经实验评估后采用。 2 GB/T21330—2007 7.3.2吸取100μL零浓度标准品于孔A1、A2：并吸取50μL零浓度标准品于孔B1、B2；分别吸取 50μL链霉素标准溶液（浓度分别为：0.25、0.5、1.0、2.0、10.0、20.0ng/mL）于孔C1、C12H1、H2；吸 取50μL样品溶液于其余微孔中。 7.3.3分别吸取25μL链霉素酶标记物溶液于除A1、A2外的每一个微孔。 7.3.4分别吸取25uL链霉素抗体溶液于除A1、A2外的每一个微孔。 7.3.5用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀。 7.3.6将酶标板置于4℃避光孵育1h。 7.3.7倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干 燥。再立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件进行洗板。要注意不能使微孔干燥。 7.3.8迅速加人100μL底物溶液于每一个微孔底部，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于 20℃~24℃避光孵育30min 7.3.9迅速加人100μL反应终止液于每一个微孔，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔 架置于酶标仪中，在450nm处测量吸光度（加人反应终止液后应在30min内读取吸光度）。 注：测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。 7.4平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 7.5空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 7.6监控试验 每次测定均应做一个添加链霉素标准（4.14）的样品，添加浓度为相应产品的最高残留限量。 8结果计算 从含有标准品和样品的板孔的吸光度（OD）值中，减去空白孔A1、A2的平均OD值。标准品和样 品的OD平均值除以零标准（B1、B2）的平均OD值，再乘以100。零标准为100%（最大吸光度值），其他 OD值为最大吸光度值的百分数。 在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标（%），链霉素标准溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制标准 工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的链霉素浓度后，结果按式（1)进行计算： ..(1) mX1000 式中： X一一样品中链霉素的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； c一从标准工作曲线上得到的样品中链霉素浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL）； m——样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。 注：也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。所得结果表示至一位小数 SAG 9确证试验 如被测样品中链霉素残留量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证。 回收率参见附录B。