ICS 67.120 x 04 中华人民共和国国家标准 GB/T21317—2007 动物源性食品中四环素类兽药残留量 检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 与高效液相色谱法 Determination of tetracyclines residues in food of animal origin- LC-MS/MS method and HPLC method 2008-04-01实施 2007-10-29发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21317—2007 前言 本标准的附录A、附录B和附录 C为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：岳振峰、谢丽琪、叶卫翔、吉彩霓、林秀云、邱月明、赵凤娟、陈沛金、周亚敏。 本标准系首次发布。 GB/T 21317—2007 动物源性食品中四环素类兽药残留量 检测方法液相色谱-质谱/质谱法 与高效液相色谱法 SAG 1范围 本标准规定了动物源性食品中四环素类兽药残留量检测的制样方法、高效液相色谱检测方法和液 相色谱-质谱/质谱确证方法。 本标准适用于动物肌肉、内脏组织、水产品、牛奶等动物源性食品中二甲胺四环素、土霉素、四环素、 去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素7种四环素类兽药残留量的高效液相色谱测定和二甲胺 四环素、差向王霉素、王霉素、差向四环素、四环素、去甲基金霉素、差向金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强 力霉素10种四环素类药物残留量的液相色谱-质谱/质谱测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， 3原理 试样中四环素族抗生素残留用0.1mol/LNazEDTA-Mcllvaine缓冲液（pH=4.0士0.05）提取，经 过滤和离心后，上清液用HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱仪或液相色谱电喷雾质谱仪测定，外标 峰面积法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：高效液相色谱纯。 4.2乙睛：高效液相色谱纯。 4.3乙酸乙酯。 4.5 三氟乙酸。 4.6 柠檬酸（C,H.O·H,O)。 4.7 磷酸氢二钠（Na,HPO·12H,O)。 4.8柠檬酸溶液：0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸（4.6）,用水溶解，定容至1000mL。 4.9磷酸氢二钠溶液：0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠（4.7），用水溶解，定容至1000mL。 4.10Mcllvaine缓冲溶液：将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液（4.8）与625mL0.2mol/L磷酸氢二 钠溶液（4.9)混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节pH=4.0士0.05。 4.11NazEDTA-Mcllvaine缓冲溶液：0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠（4.4）放人 1625mLMcllvaine缓冲溶液（4.10）中，使其溶解，摇匀。 4.12甲醇+水（1+19）：量取5mL甲醇（4.1)与95mL水混合。 1 GB/T21317—2007 4.13甲醇+乙酸乙酯（1十9：量取10mL甲醇（4.1)与90mL乙酸乙酯（4.3）混合。 4.14OasisHLB固相萃取柱：60mg，3mL,或相当者。使用前分别用5mL甲醇和5mL水预处理， 保持柱体湿润。 4.15三氟乙酸水溶液（10mmol/L）：准确吸取0.765mL三氟乙酸于1000mL容量瓶中，用水溶解并 定容至刻度。 4.16甲醇+三氟乙酸水溶液（1十19）：量取50mL甲醇（4.1)与950mL三氟乙酸水溶液（4.15）混合。 4.17标准物质：二甲胺四环素（minocycline，CAS：10118-90-8），土霉素（oxytetracycline， CAS：6153-64-6），四环素（tetracycline，CAS：60-54-8），去甲基金霉素（demeclocycline， CAS：127-33-3），金霉素（chlortetracycline，CAS：57-62-5），甲烯王霉素（methacycline， CAS：914-00-1），强力霉素（doxycycline，CAS：564-25-0），差向四环素（4-epitetracycline， CAS：64-75-5），差向土霉素（4-epioxytetracycline，CAS：35259-39-3），差向金霉素（4-epichlortetracy cline，CAS：14297-93-9）。纯度均大于等于95%。 4.18标准溶液 4.18.1标准储备溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基 金霉素、金霉素、甲烯土霉素，强力霉素、差向土霉素、差向四环素和差向金霉素各10.0mg，分别用甲醇 月以上。 4.18.2混合标准工作溶液：根据需要，用甲醇十三氟乙酸水溶液（4.16）将标准储备溶液（4.18.1）配 制为适当浓度的混合标准工作溶液。混合标准工作溶液应使用前配制。 5仪器 5.1液相色谱串联四极杆质谱仪或相当者，配电喷雾离子源。 5.2高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器或紫外检测器。 5.3分析天平：感量0.1mg，0.01g。 5.4旋涡混合器。 5.5低温离心机：最高转速5000r/min，控温范围为一40℃至室温。 5.6吹氮浓缩仪。 5.7 固相萃取真空装置。 5.8pH计：测量精度±0.02 5.9组织捣碎机。 5.10超声提取仪。 6样品制备与贮存 制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。 6.1动物肌肉、肝脏、肾脏和水产品 于一18℃以下冷冻存放 6.2牛奶样品 存放。 2 GB/T 21317—2007 7测定步骤 7.1提取 7.1.1动物肝脏、肾脏、肌肉组织、水产品 称取均质试样5g（精确到0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，分别用约20mL、20mL、 10mL0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲溶液（4.11)冰水浴超声提取三次，每次旋涡混合1min，超声 提取10min，3000r/min离心5min（温度低于15℃），合并上清液（注意控制总提取液的体积不超过 50mL），并定容至50mL，混匀，5000r/min离心10min（温度低于15℃），用快速滤纸过滤，待净化。 7.1.2牛奶 称取混匀试样5g（精确到0.01g），置于50mL比色管中，用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲溶 液（4.11）溶解并定容至50mL，旋涡混合1min，冰水浴超声10min，转移至50mL聚丙烯离心管中， 冷却至0℃～4℃，5000r/min离心10min（温度低于15℃），用快速滤纸过滤，待净化。 7.2净化 准确吸取10mL提取液（相当于1g样品）以1滴/s的速度过HLB固相萃取柱（4.14），待样液完 全流出后，依次用5mL水和5mL甲醇十水（4.12）淋洗，弃去全部流出液。2.0kPa以下减压抽干 5min，最后用10mL甲醇十乙酸乙酯（4.13）洗脱。将洗脱液吹氮浓缩至干（温度低于40℃），用 渣，过0.45um滤膜，待测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱-质谱/质谱法 7.3.1.1液相色谱条件 色谱柱：InertsilC8-3，5um，150mm×2.1mm（内径），或相当者； b) 流动相：甲醇（4.1）+10mmol/L三氟乙酸（4.15），梯度洗脱（梯度时间表见表1)； 表1分离10种四环素类药物的液相色谱洗脱梯度 时间/min 甲醇/% 10mmol/L三氟乙酸/% 5.0 95.0 5. 0 30. 0 70. 0 10.0 33.5 66.5 12. 0 65.0 35. 0 17.5 65.0 35.0 18.0 5. 0 95.0 25.0 5.0 95.0 流速：300μL/min； c) d) 柱温：30℃； e）i 进样量：30μL。 7.3.1.2质谱条件 离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI十）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）：分辨率：单位分 辨率；其他参考质谱条件见附录A。 7.3.1.3定性测定 7.3.1.3.1保留时间 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在2.5%之内。 3