ICS 67.120 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21314—2007 动物源性食品中头孢匹林、头孢噻呋 残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of cephapirin and ceftiofur residues in foodstuffs of animal origin- LC-MS/MS method 2007-10-29发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21314—2007 前言 本标准附录A、附录B、附录C为资料性附录 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：李一尘、林维宣、唐英章、田苗、彭涛、于灵、隋凯、杨春光、王宏伟 本标准为首次发布。 GB/T21314—2007 动物源性食品中头抱匹林、头抱噻 残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了动物源性食品中头孢匹林，头抱噻残留量液相色谱-质谱/质谱测定和确证方法。 本标准适用于动物肌肉、肝脏、肾脏、鸡蛋和牛奶中头孢匹林（cephapirin）、头孢噻（ceftiofur）残 留量的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696：1987) 3原理 样品中头孢匹林、头孢噻呋残留物用乙睛-水溶液提取，提取液经浓缩后，用缓冲溶液溶解，固相萃 取小柱净化，洗脱液经氮气吹干后，用液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682一1992规定的一级水， 4.1乙睛：高效液相色谱级。 4.2甲醇：高效液相色谱级。 4.3甲酸：高效液相色谱级。 4.4氯化钠。 4.5 氢氧化钠。 4. 6 磷酸二氢钾。 4.7 磷酸氢二钾。 4. 8 0.1mol/L氢氧化钠：称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1000mL。 4.9Z 乙睛十水（15十2，体积比）。 4.10乙睛十水（30十70，体积比）。 4.110.05mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=8.5）：称取8.7g磷酸氢二钾，超纯水溶解，稀释至 1000mL.用磷酸二氢钾调节pH值至8.5土0.1。 4.12 20.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）：称取3.4g磷酸二氢钾，超纯水溶解，稀释至 1000mL，用氢氧化钠调节pH值至7.0土0.1。 4.130.01mol/L乙酸铵溶液（pH=4.5）：称取0.77g乙酸铵，超纯水溶解，稀释至1000mL，用甲酸 调节pH值至4.5±0.1。 4.14头孢匹林、头孢噻呋标准品：纯度均大于等于95%。 4.15头孢匹林、头孢噻呋标准储备溶液：分别称取适量标准品（4.14），分别用乙水溶液（4.10）溶解 1 GB/T213142007 定容至100mL，溶液浓度为100μg/mL，置于一18℃冰箱避光保存，保存期5d。 4.16头孢匹林、头孢噻呋混合标准中间液：分别吸取适量标准储备液（4.15）于100mL容量瓶中，用 度分别为100ng/mL、5000ng/mL。置于一4℃冰箱避光保存，保存期5d。 列的混合标准工作溶液（用时现配）。 4.18固相萃取Cis柱：500mg，6mL。使用前用甲醇和水预处理，即先用2mL甲醇淋洗小柱，然后用 1 mL水淋洗小柱。 5仪器 5.1液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2旋转蒸发器。 5.3固相萃取装置。 5.4离心机。 5.5均质器。 5.6旋涡混合器。 5.7 pH计。 5.8氮吹仪。 6试样制备与保存 取代表性样品，用组织捣碎机充分捣碎，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18C以下冷冻 存放。 7检测步骤 7.1提取 7.1.1肝脏、肾脏、肌肉组织、鸡蛋样品 称取约5g试样（精确到0.01g）于50mL离心管中，加人15mL乙睛水溶液（4.9），均质30s， 4000r/min离心5min，上清液转移至50mL离心管中；另取一离心管，加人10mL乙睛水溶液（4.9）， 洗涤均质器刀头，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，加人上述洗涤均质器刀头溶液，在旋涡混合器上振荡 1min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙睛水溶液（4.9）洗涤刀 头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙水溶液（4.9）定容至40mL。准确移取20mL入 100 mL鸡心瓶。 7.1.2牛奶样品 称取10g样品（精确到0.01g）于50mL离心管中，加人20mL乙睛（4.9），均质提取30s， 4000r/min离心5min，上清液转移至50mL离心管中；另取一离心管加入10mL乙睛水溶液（4.9）， 洗涤均质器刀头，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，加人上述洗涤均质器刀头溶液，在旋涡混合器上振荡 1min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙睛水溶液（4.9）洗涤刀 头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙水溶液（4.9）定容至50mL。准确移取25mL入 100mL鸡心瓶。 将鸡心瓶于旋转蒸发器上（37℃水浴）蒸发除去乙腈（易起沫样品可加人4mL饱和氯化钠溶液）。 7.2净化 立即向已除去乙睛的鸡心瓶中加入25mL磷酸盐缓冲溶液（4.11），涡旋混匀1min，用0.1mol/l 氢氧化钠调节pH值为8.5,以1mL/min的速度通过经过预处理的固相萃取柱，先用2mL磷酸盐缓冲 2 GB/T21314—2007 溶液（4.11）淋洗2次，再用1mL超纯水淋洗。用3mL乙洗脱（速度控制在1mL/min）。将洗脱液 于45℃下氮气吹干，用0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.12）定容至1mL，过0.45μm滤膜后，立即用 液相色谱-质谱/质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 7.3.1.1色谱柱：COSMOSILCis柱，250mmX4.6mm(内径），粒度5μm。 7.3.1.2流动相：A组分是0.01mol/L乙酸铵溶液（甲酸调pH至4.5);B组分是乙睛。梯度洗脱程 序见表1。 表1 梯度洗脱程序 步 骤 时间/min 流速/（mL/min） 组分A/% 组分 B/% 1 0.00 1. 0 98.0 2. 0 2 3.00 1. 0 98.0 2.0 3 5. 00 1, 0 90.0 10. 0 4 15.00 1. 0 70.0 30. 0 5 20.00 1. 0 98.0 2.0 7.3. 1. 3 流速：1.0mL/min。 7. 3. 1. 4 进样量：100μL。 7.3.2质谱条件 7.3.2.1离子源：电喷雾离子源。 7.3.2.2扫描方式：正离子扫描。 7.3.2.3检测方式：多反应监测。 7.3.2.4雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气：使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测 要求，参考条件见附录A。 7.3.3液相色谱-质谱/质谱测定 S21C 根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱分析。标准工作液和 待测液中头孢匹林、头孢噻呋的响应值均应在仪器线性响应范围内。对标准工作液和样液等体积进行 测定。在上述色谱条件下头孢匹林和头孢噻的参考保留时间分别约为12.2min、13.0min。标准溶 液的选择性离子流图见图B.1。 7.3.4定性测定 按照上述条件测定样品和建立标准工作曲线，如果样品中化合物质量色谱峰的保留时间与标准溶 液相比在土2.5%的允许偏差之内；待测化合物的定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于3 （S/N≥3），定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于10（S/N≥10）；定性离子对的相对丰度 与浓度相当的标准溶液相比，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在相应的目标化 合物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.3.5定量测定 按外标法使用标准工作曲线进行定量测定。 7.3.6空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。