ICS 65.120 B 46 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 22261—2008 饲料中维吉尼亚霉素的测定 高效液相色谱法 Determination of virginiamycin in feeds- High performance liquid chromatography 2008-08-01发布 2008-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22261—2008 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（南京） 本标准主要起草人：冯三令、耿士伟、储瑞武、冯群科、贾书静 1 GB/T22261—2008 饲料中维吉尼亚霉素的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了饲料中维吉尼亚霉素含量的高效液相色谱测定方法， 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中维吉尼亚霉素含量的测定，检出限为 0. 5mg/kg,定量限为2mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 饲料中的维吉尼亚霉素用乙酸乙酯提取出来，提取液经硅胶柱和亲水亲脂平衡型固相萃取柱净化， 在高效液相色谱仪（HPLC)反相柱上分离，用紫外检测器（或二极管阵列检测器）在210nm波长处检 4试剂和溶液 除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T6682中一级用水规定 4.1乙酸乙酯。 4.2无水硫酸钠。 4.3正已烷。 4.4无水乙酸乙酯-正已烷：将乙酸乙酯和正已烷按体积1+1混合，通过无水硫酸钠脱水。 4.5乙腈。 4.6甲醇。 4.7乙酸铵缓冲溶液（pH4.0）：0.05mmol/L。称取3.85g无水乙酸铵，溶解于1000mL水中，用冰 乙酸调节pH至4.0。 4.8甲醇-乙酸铵缓冲溶液：将甲醇和乙酸铵缓冲溶液（4.7)按1：3比例混合，摇匀。 4.940%甲醇-水溶液：将甲醇和水按4十6比例混合，摇匀。 4.10乙睛：色谱纯，用于配制流动相。 4.11磷酸。 4.12流动相：乙十水十磷酸=400+600+1，混匀，用前脱气。 4.13维吉尼亚霉素标准溶液 4.13.1维吉尼亚霉素标准品：维吉尼亚霉素M，和S总和不少于95.0%。 4.13.2维吉尼亚霉素标准贮备液：准确称取维吉尼亚霉素标准品（4.13.1)100mg，置于100mL棕色 1 GB/T22261—2008 量瓶中，用乙睛（4.5）溶解定容，摇匀，该溶液中维吉尼亚霉素浓度为1mg/mL。贮存于4℃冰箱中，有 效期三个月。 4.13.3维吉尼亚霉素标准系列工作液：准确吸取维吉尼亚霉素标准贮备液（4.13.2）置于棕色量瓶中， 中，有效期一周。 5仪器和设备 5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器 5.22 分析天平：感量0.1mg。 5.3涡旋混合器。 5.4走 超声波水浴仪。 5.5离心机：4000r/min。 5.6 氮吹仪：可控温50℃。 5.7[ 固相萃取柱 5.7.1硅胶柱：690mg/3mL。 5.7.2亲水亲脂平衡型固相萃取柱：60mg/3mL 5.8固相萃取装置。 5.9 pH计。 5.100.45μm微孔滤膜。 6试样制备 6.1按GB/T14699.1采样。 6.2选取有代表性饲料样品至少500g，按GB/T20195制备样品。 7测定步骤 7.1提取 称取试样适量（配合饲料、浓缩饲料2g~5g，预混料1g~2g），精确至1mg，置于50mL离心管 中，加2mL水，使试样充分湿润并混匀，加人20mL乙酸乙酯（4.1），加盖，置涡旋混合器上混匀后，置 超声波水浴中超声提取30min。于离心机上以4000r/min离心10min。 准确吸取10mL上层乙酸乙酯清液于另一离心管中，加人5g无水硫酸钠（4.2）和10mL正已烷 （4.3），置涡旋混合器上充分混匀后，于离心机上以4000r/min离心10min，上清液备用。 7.2净化 用2.5mL无水乙酸乙酯-正已烷（4.4)预淋洗活化硅胶柱（5.7.1)，将上清液（7.1)小心转移人硅胶 柱内（保持过柱流速不超过2mL/min，且不得抽干），用5mL无水乙酸乙酯-正已烷（4.4）洗涤离心管 中无水硫酸钠，洗涤液一并转移人硅胶柱内，抽干，用2mL乙腈（4.5)淋洗硅胶柱，抽干。 用1mL甲醇（4.6）和1mL乙酸铵缓冲溶液（4.7）预淋洗活化亲水亲脂平衡型固相萃取柱 （5.7.2），将抽干的硅胶柱安装在亲水亲脂平衡型固相萃取柱（5.7.2）的上面，用5mL甲醇-乙酸铵缓冲 2mL/min。淋洗完毕后，弃去硅胶柱，用5mL40%甲醇-水溶液（4.9）淋洗亲水亲脂平衡型固相萃取柱 （5.7.2），弃去淋洗液。最后用5mL甲醇（4.6）进行洗脱，收集洗脱液，于50℃C氮吹仪上蒸发至干，用 0.5mL~5mL的流动相（4.12）溶解残渣，过0.45um微孔滤膜，供上机测定。 7.3色谱条件 7.3.1色谱柱：Cis柱，长150mm，内径4.6mm，粒径5μm，或相当者。 2 GB/T22261—2008 7. 3. 2 2柱温：室温。 7.3.3流动相：同4.12。 7.3.4流速:1.0 mL/min。 7.3.5检测器：紫外检测器（或二极管阵列检测器），检测波长210nm。 7.3.6进样体积：20μL。 7.4定量测定 按上述色谱条件，分别将维吉尼亚霉素标准系列工作液（4.13.3）及试样溶液（7.2）上机测定，根据 维吉尼亚霉素MI和S峰面积加和值，用外标法定量。 7.5结果计算 试样中维吉尼亚霉素的含量（X）以质量分数（mg/kg）表示，按式（1)计算： mXV2 式中： X-一试样中维吉尼亚霉素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 试样溶液中M,和S色谱峰面积加和值对应的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； Vi- 加人试样中的乙酸乙酯总体积，单位为毫升（mL）； 最终溶解残渣用流动相的体积，单位为毫升（mL）； m—试样质量，单位为克（g）； V2一—移取的乙酸乙酯体积，单位为毫升（mL）。 结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 8 精密度 在重复性试验条件下两次平行测定结果的相对偏差不大于10%。