ICS 67.100 X 04 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T 22287—2008 贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通RT一PCR方法和 实时荧光RT一PCR方法 Detection of hepatitis a virus in shellfish- Contentional RTPCR and real-time fluorescence RTPCR 2008-08-12发布 2008-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 22287—2008 前言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：陈广全、饶红，段洪安、冯骞、付薄博、张惠媛、汪琦、曾静、张睿、李金华。 SZAG GB/T22287—2008 贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通RT一PCR方法和 实时荧光RT一PCR方法 1范围 本标准规定了贝类中甲型肝炎病毒的普通RT一PCR和荧光RT一PCR检测方法。 本标准适用于贝类中甲型肝炎病毒核酸的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD） GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因分析检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR DNA模板先经高温变性为单链，在适宜的温度下和缓冲液中，两条引物分别与模板DNA两条链 上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP为底物，使退火引物得以延 伸，如此反复变性、退火和延伸，使位于两段引物序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增 3. 2 反转录-聚合酶链式反应 reversetranscription polymerasechain reaction,RTPCR RNA在逆转录酶的作用下，适宜反应条件下，被逆转录成cDNA，以cDNA作为模板进行PCR。 3.3 实时荧光RT—PCRreal-timefluorescenceRT一PCR 实时荧光RT一PCR方法是在常规RT一PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针。该探针为 一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧 光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和 率灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分 子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 3. 4 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 4缩略语 下列缩略语适用于本标准。 1 GB/T22287—2008 4.1HAV:甲型肝炎病毒。 4.2TCIDso：组织培养半数感染量，是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，一般使用Reed Muench方法计算。 5试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水均为去离子水，规格符合GB/T6682相关 规定。 5.1甘氨酸缓冲液：见附录A中的A.1.1。 5.2PEG8000沉降液：见附录A中的A.1.2。 5.3裂解液：Trizol-reagent或其他等效产品。 5.4Poly(dt)磁珠：Dynalbeads-oligo(dt)25或其他等效产品 注：给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可 使用这些等效产品。 5.5 51×RNA吸附缓冲液：见附录A中的A.2.5。 5.62×RNA吸附缓冲液：见附录A中的A.2.6 5.7洗涤缓冲液：见附录A中的A.2.7。 5.8QIAampViralRNAMiniKit（Qiagen529004)"或其他等效产品。 5.9SuperscriptTM one-step RT-PCR with platinum Taq(Invitrogen Cat.No.10928-034)1或其他 等效产品。 5.10 SuperscriptTM first-strand syhthesis system for RTPCR(Invitrogen Cat.No.18080-051)或 其他等效产品。 5.11UniversalPCRMasterMix（ABI4304437)或其他等效产品。 5.12普通RT—PCR检测引物序列（5-3"） 正义引物(No.P1) CAGCACATCAGAAAGGTGAG 反义引物（No.P2） CTCCAGAATCATCTCCAAC 加无RNase的去离子水配制成100μmol/L储备液。 5.13实时荧光RT一PCR检测的引物和探针 引物或探针序列（5-3） 正义引物（HAV1) TTTCCGGAGCCCCTCTTG 反义引物（HAV2) AAAGGGAAATTTAGCCTATAGCC 反义引物（HAV3） AAAGGGAAAATTTAGCCTATAGCC 探针 FAM—ACTTGATACCTCACCGCCGTTTGCCTTAMRA 加无RNase的去离子水配制成100μmol/L储备液。 5.14DNA分子量标记：100bp~2000bp。 5.1550×TAE或其他等效缓冲液：见附录A中的A.1.3。 5.1610×上样缓冲液：见附录A中的A.1.6。 5.17甲肝减毒活疫苗：作为阳性对照添加于已知的阴性贝类样品中制成阳性质控样品。 5.18三氯甲烷：每次使用时注意防止Rnase污染。 5.19 异丙醇：每次使用时注意防止Rnase污染。 1）给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可 使用这些等效产品。 2 GB/T22287—2008 5.2075%乙醇：见附录A中的A.2.4。 5.21无RNase的去离子水：见附录A中的A.2.3。 5.22溴化乙锭（10μg/μL)：见附录A中的A.1.4。 5.23 焦碳酸二乙酯。 6仪器与设备 6.1 组织匀浆器（0r/min～20000r/min）。 6.2 PCR仪（PE9600或其他等效设备）。 6.3 实时荧光PCR仪（ABI7000或其他等效设备）。 6.47 凝胶成像系统。 6.5恒温水浴（10℃~95℃）。 6.6涡旋混匀器（200r/min～2500r/min）。 6.7 电泳仪(0V~300V)。 6. 8 酸度计（0~14.00pH，最小显示单位0.01pH,1mV）。 6. 9 高速冷冻离心机（MeckmanmodelJ2-21或其他等效设备）。 6. 10 微量加样器（0.1μ~2μL，1μL~10μL，20μ~100μL,100μL~1000μL，1000μ~ 5 000 μL)。 6.11超低温冰箱（-80℃)。 6.12带滤心的无Rnase的微量加样器吸头（10μL，100μL，200μL，1mL）。 6.13无RNase的离心管和PCR反应管（20μL,1.5mL，2mL）。 6.14磁力搅拌器。 6.15电子天平（最小精度值0.01g）。 7样品处理 7.1样品的运输与保存 样品至少应在4℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测，如果暂时不能检 测应将样品保存于一80℃冰箱中。 7.2取样 用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体，使用灭菌消毒的剪刀和 镊子取贝的消化道组织10g。 8病毒的富集 10g贝类消化道组织中加人70mL甘氨酸缓冲液（样品质量与缓冲液体积之比为1：7），组织匀浆 器中充分破碎混匀2min。取出勾浆液30mL，置37℃孵育30min。于4℃，15000g，离心20min。 收集上清液，加人等体积三氯甲烷，涡旋混匀1min，室温放置5min，1700g，4℃，离心30min。从上 层液相取出15mL上清液，加人等体积的PEG8000溶液（PEG终浓度为8%），于4℃过夜沉降病毒。 10000g，4℃，离心5min。弃上清，保留沉淀。选择下列两种方法之一进行RNA提取 9病毒RNA提取 9.1硅胶膜法 向沉淀中加入6mol/L的异硫氰酸胍溶液1mL尽量使沉淀充分溶解，涡旋混匀，使用Qiagen的 QIAampViralRNAMiniKit或其他等效产品进行RNA提取。按照厂家的试剂盒使用说明进行 操作。 3