ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 17813—2018 代替GB/T17813—1999 添加剂预混合饲料中烟酸与叶酸的测定 高效液相色谱法 Determination of nicotinic acid and folic acid in premix- High performance liquid chromatography 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 17813—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T17813—1999《复合预混料中烟酸、叶酸的测定高效液相色谱法》。 本标准与GB/T17813一1999相比，除编辑性修改外，主要技术内容修改如下： 修改了方法的检测限，增加了定量限（见第1章，1999年版的第1章）； 修改了标准名称； 修改了烟酸、叶酸测定原理（见第3章和第4章，1999年版的第3章）； 修改了烟酸和叶酸的提取液组成（见第3章和第4章，1999年版的4.6）； 修改了烟酸和叶酸流动相与色谱条件（见3.2.7、3.5.2和4.5.2，1999年版的7.2.1.1）； 修改了烟酸标准溶液的配制方法（见3.2.9，1999年版的4.5.1）； 复合预混合饲料提取方法中，增加了二水合乙二胺四乙酸二钠（EDTA）使用（见3.5.1.2和 4.5.1.2,1999年版的7.1); 增加了烟酸、叶酸的标准色谱图（见附录A）。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京）。 本标准主要起草人：李兰、贾铮、索德成。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T17813—1999。 1 GB/T17813—2018 添加剂预混合饲料中烟酸与叶酸的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准适用于维生素预混合饲料及复合预混合饲料中烟酸、叶酸的测定 烟酸的检测限为100mg/kg，定量限为300mg/kg；叶酸的检测限为15mg/kg，定量限为50mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3烟酸的测定 3.1原理 试样中烟酸用酸性甲醇水溶液提取，采用高效液相色谱仪分离，紫外检测，外标法定量。 3.2 2试剂或溶液 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中一级水的规定。 3.2.1冰乙酸：优级纯 3.2.2庚烷磺酸钠：色谱纯。 3.2.3三乙胺：优级纯 3.2.4甲醇：色谱纯。 3.2.50.1%三氟乙酸溶液：移取1mL三氟乙酸于1000ml水中。 3.2.6提取液：称取50mg二水合乙二胺四乙酸二钠（以下简称EDTA）溶于约800mL水中，加入 20mL冰乙酸（3.2.1）、5mL三乙胺（3.2.3），混匀后与200mL甲醇混合，该溶液pH值约为3～4。 3.2.7流动相：称取1.1g庚烷磺酸钠（3.2.2）、50mgEDTA溶于约1000mL水中，加人20mL冰乙酸 （3.2.1）、5mL三乙胺（3.2.3），混匀，用冰乙酸、三乙胺调节溶液pH值为4.0，过0.45μm滤膜。取上述 溶液800mL与200mL甲醇（3.2.4)混合，备用。 3.2.8烟酸标准品：烟酸含量≥98.0%。 3.2.9烟酸标准储备溶液：准确称取0.1g（精确到0.0001g）烟酸标准品（3.2.8），置于100mL棕色容 量瓶中，加水使其溶解，并加人1mL0.1%三氟乙酸溶液（3.2.5），用水定容至刻度，摇匀。该标准储备 液中烟酸含量约为1mg/mL,2℃~8℃保存，有效期为6个月。 3.2.10烟酸标准工作液：根据试样种类（维生素预混合饲料、复合预混合饲料）调整稀释倍数，使标准 1 GB/T17813—2018 工作液浓度在10μg/mL150μg/mL，用提取液（3.2.6）稀释定容。当日制备并使用。 3.3仪器设备 3.3.1 天平：感量0.0001g、感量0.001g。 3.3.2离心机：转速不低于8000r/min（相对离心力不低于6010g）。 3.3.3超声波水浴。 3.3.4高效液相色谱仪：配紫外可调波长检测器（或二极管矩阵检测器）。 3.4样品 按照GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195制备试样，粉 碎过0.425mm孔径筛，充分混匀，储存在密闭容器中，避光保存。 3.5试验步骤 3.5.1试样的提取 3.5.1.1维生素预混合饲料的提取 称取试样0.5g（精确到0.001g），置于100mL棕色容量瓶中，加入提取液（3.2.6）约70mL，边加边 摇勾后置于超声水浴中超声提取15min，期间摇动2次，待冷却后用提取液（3.2.6）定容至刻度，摇匀。 取约25mL上述溶液于离心机8000r/min离心5min，取上清液用提取液（3.2.6）稀释10倍后过 0.45μm微孔滤膜，上机测定。 3.5.1.2复合预混合饲料的提取 称取试样约1g（精确到0.001g），置于100mL棕色容量瓶中，加入1gEDTA钠盐，边摇动边加人 提取液（3.2.6）约70mL，置于超声水浴中超声提取15min，期间摇动2次，待冷却后用提取液（3.2.6）定 容至刻度，摇匀。取适量溶液于离心机8000r/min离心5min或过滤，取上清液过0.45um微孔滤膜， 上机测定。 3.5.2参考色谱条件 色谱柱：Cis柱，长250mm，内径4.6mm，粒径5uμm或性能相当者。 流动相：见3.2.7。 流速：1.0mL/min。 温度：室温。 检测波长：262nm。 进样量：20μL。 3.5.3测定 取烟酸标准工作液（3.2.10）和试样溶液（3.5.1)分别进样，得到色谱峰面积响应值，在线性范围内， 用外标法单点校正，测定，以保留时间定性，峰面积定量。烟酸标准色谱图参见附录A中图A，1。 3.6试验数据处理 试样中烟酸的含量，以质量分数计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1)计算： PXVXcXVs w= ..(1) Pst XmXV 2 GB/T17813—2018 式中： P一一试样溶液峰面积值； V 试样稀释体积，单位为毫升（mL）： 烟酸标准溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； c Vi——试样溶液进样体积，单位为微升（μL)； Vt一一烟酸标准溶液进样体积，单位为微升（uL)； Pst—烟酸标准溶液峰面积平均值； m 试样质量，单位为克（g）； 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 3.7精密度 对于烟酸含量小于或等于500mg/kg的添加剂预混合饲料，在重复性条件下获得的两次独立测定 结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%。 其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。 4叶酸的测定 4.1原理 试样中叶酸用弱碱液提取，采用高效液相色谱仪分离检测，紫外检测，外标法定量， 4.2试剂或溶液 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中一级水的规定。 4.2.10.1mol/L碳酸钠溶液：称取5.3g无水碳酸钠，溶解于500mL水中。 4.2.22mol/L碳酸钠溶液：称取106g无水碳酸钠，溶解于500mL水中。 4.2.3饱和EDTA溶液：称取120gEDTA于1000mL烧杯中，加水1000mL，搅拌并超声溶解1h， 即得。 4.2.4复合预混料提取液：饱和EDTA溶液+2mol/L碳酸钠溶液溶液=80十25，pH=9。 4.2.5叶酸标准品：叶酸含量≥95.0%。 4.2.6叶酸标准储备溶液：准确称取0.05g（精确到0.0001g）叶酸标准品（4.2.5），置于100mL棕色容 量瓶中，加人0.1mol/L碳酸钠溶液（4.2.1），超声使其溶解，稀释定容至刻度，摇匀。该标准储备液中叶 酸含量为500μg/mL，2℃～8℃保存，有效期6个月。 4.2.7叶酸标准工作液：根据样品种类（维生素预混合饲料、复合预混合饲料）调整稀释倍数，使标准工 作液中叶酸浓度约为5.0μg/mL~10.0μg/mL，用0.1mol/L碳酸钠溶液（4.2.1）稀释定容。当日制备 并使用。 4.3仪器设备 同3.3。 4.4样品 同3.4。 3