ICS11.040.55 C 30 中华人民共和国国家标准 GB/T 36136—2018 结核分枝杆菌耐药基因芯片检测 基本要求 General requirements of DNA array-based M. tuberculosis drug resistance detection 2018-12-01实施 2018-05-14发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36136—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421）提出并归口。 本标准起草单位：博奥生物集团有限公司、中国疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：郭永、祝令香、赵雁林、刘莹莹、王璨、项光新、逢宇。 GB/T361362018 结核分枝杆菌耐药基因芯片检测 基本要求 1范围 本标准规定了结核分枝杆菌耐药基因芯片检测基本要求。 本标准适用于源自临床样品的结核分枝杆菌对常用一、二线抗结核药物的耐药性相关基因的检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 YY/T1153体外诊断用DNA微阵列芯片 YY/T1154激光共聚焦扫描仪 医疗机构临床基因扩增管理办法（卫办医政发[2010]194号） 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid) PCR：聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction） 4原理 根据临床常见的结核分枝杆菌耐药基因的特异性保守核酸序列，设计特异性的PCR扩增引物及相 应的寡核苷酸探针。 以临床样品中分离的结核分枝杆菌DNA为模板，加人带有末端发光标记物的引物，运用PCR技 术扩增其耐药基因目标片段，扩增后的待测DNA即带有发光标记物。 将标记有发光标记物的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定的条件下进行杂交反应，根据碱基互 补配对原则，序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构。根据探针在芯片上的特定排布位 置，就可以检测出相应被测DNA的相关信息，推断出样品的耐药基因信息。 仪器材料与试剂 5.1仪器与材料 应符合YY/T1154要求并获得医疗器械注册证书的微阵列芯片扫描仪、微阵列芯片杂交盒、核酸 扩增仪、芯片杂交仪（备选）、芯片洗干仪（备选）、冰箱（一20℃）、微量加样器及加样器吸头、恒温水浴 锅、微量离心机、离心管、恒温摇床、芯片洗涤容器及玻片架。 1 GB/T36136—2018 5.2试剂 一般包含芯片、盖片、PCR扩增试剂、阳性对照品、阴性对照品、杂交缓冲液、冰水混合物、水、临床 样品液化试剂（将临床痰样本进行液化处理）、缓冲液等组成部分，其中芯片应符合YY/T1153要求 6样本采集与处理 6.1培养物样本 6.1.1固体培养基上的培养物样本 从满足临床检测要求的固体培养基上，用环内径大于或等于1.5mm的接种环刮取培养物进行核 酸提取，应避免挑取固体培养基。 6.1.2液体培养基中的培养物样本 应选用满足临床检测要求的液体培养基，对于含有指示剂的液体培养基，取报告阳性结果的液体培 养物进行核酸提取；对于不含指示剂的液体培养基，取肉眼可识别混浊的液体培养物进行核酸提取 6.2痰样本 取涂片结果阳性（结果大于等于一个加号）的痰样本加人临床样品液化试剂液化，然后离心弃上清， 沉淀用缓冲液洗涤，即可进行后续的核酸提取 6.3 3其他类型样本 应根据样本类型，采用适宜的处理方式。 7操作方法 7.1 实验室标准化设置与管理 实验室标准化设置与管理应遵照执行《医疗机构临床基因扩增管理办法》。 7.2核酸提取 在标本制备区进行。可使用各种经过验证不影响后续检测步骤的提取方法。提取后，将所得核酸 7.3检测 7.3.1配制PCR反应体系 在试剂储存和准备区进行，根据被测样品数目准备PCR离心管，并预先标记样品编号。将PCR折 增试剂混匀后，用微量离心机离心至管底 根据样品数目，用微量加样器及加样器吸头将PCR扩增试剂分装于PCR离心管中，盖好管盖，然 后将其转移至扩增反应混合物配制和扩增区。 在扩增反应混合物配制和扩增区内往上一步配好的PCR离心管中加模板核酸。模板核酸包括 已提取的待测样品核酸、阳性对照品或者阴性对照品。每次扩增时均使用阳性对照品和阴性对照品。 2 GB/T36136—2018 7.3.2PCR扩增 在扩增反应混合物配制和扩增区进行，将PCR离心管置于核酸扩增仪中，设定热循环程序，进行 PCR扩增。PCR扩增反应参数应严格按照说明书进行。 7.3.3芯片杂交 7.3.3.1杂交反应参数 杂交反应参数应严格按照说明书执行。 7.3.3.2芯片的准备 芯片杂交过程在扩增产物分析区进行。在微阵列芯片杂交盒的底部加入水以保持杂交湿度，将芯 片放人盒内，芯片正面向上，放上盖片。放置顺序如图1所示。 /盖片 芯片 介 杂交合 ↑ 图1放置顺序芯片及盖片 7.3.3.3杂交反应混合物的制备 根据被测样品数目准备离心管并编号。将杂交缓冲液充分混勾后，用微量离心机瞬时离心，分装到 离心管中。将PCR产物变性后与杂交缓冲液混合，或与杂交缓冲液混合后再变性，制备成杂交反应混 合物。 7.3.3.4杂交反应 将杂交反应混合物，用微量加样器吹吸混匀，在准备好的芯片的盖片加样孔加人杂交反应混合物 迅速盖上杂交盒并密封。每个微阵列限加一份相应的杂交反应混合物。记录芯片编号、微阵列位置及 对应的样品编号。 立即将密封好的杂交盒水平放人杂交温度预热的恒温水浴锅或芯片杂交仪中杂交。 7.3.3.5芯片洗涤液的准备 根据芯片数量配制芯片洗涤液，混合均匀并平衡至洗涤温度。 7.3.3.6芯片的洗涤与干燥 杂交反应结束后，将杂交盒水平取出拆开，将芯片取出，进行芯片洗涤。芯片的洗涤可使用芯片洗 干仪根据操作说明进行洗涤；或手工洗涤，方法如下：将取出的芯片立即放在盛有平衡至洗涤温度的芯 片洗涤液的芯片洗涤容器内的玻片架上，洗涤液应浸没芯片，在恒温摇床上洗涤。洗涤后干燥芯片并 扫描。 7.3.3.7芯片扫描和结果判读 使用微阵列芯片扫描仪和相应软件进行信号的读取及结果判读。芯片扫描仪应严格按照说明书 执行。