ICS 59.080.01 W 04 中华人民共和国国家标准 GB/T36433—2018 纺织品 山羊绒和绵羊毛的 混合物DNA定量分析 荧光PCR法 Textiles-DNA quantitative analysis of cashmere and wool mixture- FluorescencePCRmethod 2019-01-01实施 2018-06-07发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36433—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国纺织工业联合会提出 本标准由全国纺织品标准化技术委员会（SAC/TC209）归口。 本标准起草单位：上海出入境检验检疫局、中纺标检验认证股份有限公司。 本标准主要起草人：费静、谢璐蔓、隋阳华、斯颖、唐敏峰、陆维民。 1 GB/T36433—2018 纺织品山羊绒和绵羊毛的 混合物DNA定量分析荧光PCR法 1范围 本标准规定了采用荧光PCR法测定纺织品中山羊绒、绵羊毛的DNA定量检测方法。 本标准适用于纺织品混合物中两组分山羊绒、绵羊毛含量的检测 本标准不适用于回用、剥色的山羊绒和绵羊毛纤维，以及安哥拉山羊毛 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T16988特种动物纤维与绵羊毛混合物含量的测定 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction;PCR 在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以4种单核苷酸（dNTP）为 DNA的体外扩增链式反应。 3.2 实时荧光定量PCR real-timefluorescencePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，再通过曲线对未知 模板进行定量或定性分析的DNA扩增方法。 3.3 引物primer 在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点并起作用的一小段单链DNA 或RNA。 3.4 TaqMan探针TaqManprobe 一种荧光基团连接在探针的5未端，而萍灭基团则在3未端的寡核苷酸链。 注：PCR扩增时在加人一对引物的同时加人一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 1 GB/T36433—2018 PCR产物形成完全同步。 3.5 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4原理 针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计物种特异的引物和探针，利用实时荧光PCR技术，建立起 山羊绒、绵羊毛混合物与它们的DNA之间的对应关系。通过对混合纤维抽提出的DNA中的山羊成 分、绵羊成分进行特异性扩增，根据得到的Ct值，计算该样品中山羊绒、绵羊毛的相对含量。 5试剂 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求。 5.1蛋白酶K溶液：称取180mg的蛋白酶（>30U/mg），溶于10mL水中，分装后置于一20℃冻存。 5.2 2二硫苏糖醇（DTT)溶液：称取1.5gDTT溶于10mL水中，分装后置于一20℃冻存。 5.3十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)：纯度>98%。 5.4 乙二胺四乙酸（EDTA）：纯度>98%。 5.5 5氯化钠。 5.6 氢氧化钠。 5.7 三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCI)：纯度>98%。 5.8苯酚。 5.9 三氯甲烷 5.1070%冰乙醇（体积分数）：一20℃冷藏。 5.11 石油醚。 5.12CTAB裂解液（pH=8.0）：含有2%CTAB（质量体积比，g/L)；0.1mol/Ltris-HCl；20mmol/L EDTA;1.4 mol/L NaCl。 5.132×TaqMan荧光定量预混液（2×TaqManuniversalMasterMix）：4℃保存，或其他等效产品 警告：2×TaqManuniversalMasterMix对眼睛和呼吸道有轻微刺激，使用时应采取完善的保护 措施。 5.14引物、探针序列信息：见表1。 6仪器和器具 6.1冰箱：-20℃~4℃。 6.2天平：分度值0.001g。 6.3空气浴振荡仪：能控制温度56℃土2℃。 6.4冷冻离心机：-20℃~40℃。 6.5涡旋仪。 6.6微量移液器及吸头：0.2μL~2μL、1μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL、200μL~ 1 000 μL. 6.7离心管:1.5mL、2.0mL。 6.8实时荧光PCR光学反应管或光学96孔板。 2 GB/T36433—2018 6.9实时荧光定量PCR仪。 6.10索氏抽提装置。 6.11液氮冷冻研磨仪。 7取样和试样的预处理 7.1取样 按照GB/T16988规定取样品，使其具有代表性，并足以提供全部所需试样，每个试样至少两份，每 份试样不少于0.2g。 7.2试样的预处理 对于经不溶性浆料、树脂等处理过的样品，如果需要可按以下方法进行预处理。 称取试样1g左右，放在索氏萃取器中，用石油醚（5.11)萃取1h，每小时至少循环6次。待试样中 石油醚挥发后，把试样浸人冷水中，浸泡1h，再在65℃士5℃水中浸泡1h，浴比为100：1，时时搅拌， 然后抽吸或离心脱水、晾干。如试样上的水不溶性浆料、树脂等非纤维物质不能用石油醚和水萃取掉， 则要用对纤维组成没有影响的特殊方法处理。 8试验条件 试验条件满足GB/T19495.1和GB/T19495.2的规定。 9试验步骤 9.1标准曲线的建立 使用直径相近的100%山羊洗净绒、100%绵羊洗净毛自制标准混合样。分别称取羊绒含量为 10%、30%、50%、70%、90%，总质量为0.5g山羊绒、绵羊毛混合物，将它们用液氮冷冻研磨仪（6.11） 粉碎，用以提取DNA。按9.2和9.3中所述试验步骤进行操作。 对仪器采集到的针对每个标准混合物的Ct值，求得Cteashmere一Ctwol两者的差值△Ct为横坐标，以 1g（1/9）、1g（3/7）1g（5/5）、1g（7/3）、1g（9/1）的值为纵坐标，进行曲线拟合，建立线性的羊绒羊毛定量标 准曲线。参见附录A标准曲线建立的示例。 9.2DNA的抽提 9.2.1将所取试样（7.1)用剪刀尽量剪碎至纤维长度0.2mm以下，也可使用液氮冷冻研磨仪（6.11）进 行研磨。 （5.12），再加入50μL蛋白酶K溶液（5.1）及150μLDTT溶液（5.2），使用涡旋仪（6.5）混匀。 9.2.3将离心管置于56℃空气浴振荡仪（6.3），以500r/min的速度振荡过夜（至少8h）。 9.2.4取出反应完成后的离心管，将其置于离心机（6.4)以10000r/min室温离心3min后，取上清液 烈颠倒20S。 9.2.5将离心管于室温离心，10000r/min，10min。取800μL的上清液至新的离心管。 3