ICS 11.220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检测方法 Method of real-time RT-PCR for the detection of the avian influenza virus subtype H7 2004-02-15实施 2004-02-14发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19438.3—2004 前言 GB/I194382004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分： GB/T19438.12004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》； GB/T19438.2—2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； —GB/T19438.3—2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； GB/T19438.4—2004《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A为资料性附录。 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人：高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹 GB/T19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检测方法 1 范围 本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3缩略语 下列缩略语适用于本部分。 3. 1 荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链式反应。 3. 2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3. 3 RNA 核糖核酸。 3. 4 bpL Taq DNA 聚合酶。 3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水。 3.6 DEPC 焦碳酸乙二酯。 4原理 采用TaqMan方法，通过比对离流感病毒血凝素基因，设计一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基 因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其 中5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（R），3'端标记的TAMRA荧光素（Q)在近距离内能吸收5'端 荧光基团发出的荧光信号，称为灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合， GB/T19438.3—2004 探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时， Taq酶发挥5'→3'的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再 为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应 关系。 5试剂和材料 5.1试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器（用DEPC 水处理后高压灭菌）进行分装 5.1.1H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒"：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附 录A。 5.1.2三氯甲烷。 5.1.3异丙醇。 5.1.475%乙醇，用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制。 5.1.50.01mol/L（pH7.2)的PBS:配方见GB/T19438.12004中附录A。121C±2℃，15min 高压灭菌后，无菌条件下按10000IU/mL加入青霉素和链霉素。 5.2仪器设备 5.2.1高速台式冷冻离心机：要求最大离心力在12000r/min以上。 5.2.2荧光PCR仪。 5.2.3计算机。 5.2.42℃~8℃冰箱。 5.2.5一20℃冰箱。 5.2.7混匀器。 5.2.8可移动紫外灯：要求近工作台面。 6样品的采集与前处理 采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 6.1取样工具 需要下列取样工具： 棉拭子； 剪刀、镊子； Eppendorf 管; 一研钵。 以上取样工具必须经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干。 6.2采样方法 6.2.1活禽样品 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法为： 对于咽喉拭子，采取时要深入喉头及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液； 取泄殖腔拭子时，将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便； 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T19438.3—2004 一将咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放人盛有1.0mLPBS的Eppendorf管中备用。 6.2.2肌肉或脏器样品 用无菌的剪刀、镊子取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，1000g离心10min 后，取上清液转人Eppendorf管中备用。 6.2.3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至Eppendorf管内备用 6.2.4保存与运送 采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，长期保存须在一70℃以下，但应避免 反复冻融（冻融不超过三次）。 样品采集后，将采集的样品密封并编号，采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室。 7操作方法 7.1实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C。 7.2样本的制备 7.2.1在样本制备区进行。 7.2.2样本的制备程序： 7.2.2.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和，对每个管编号标记。 换用一个吸头；再加人200μL三氯甲烷，混匀器上剧烈震荡混匀5S。于4℃条件下，12000r/min离 心 15 min。 对每个管编号标记。 7.2.2.4吸取7.2.2.2离心后各管中的上清液转移至已加人异丙醇的相应管中，上清液至少吸取 500uL，不要吸出中间层，颠倒混匀。 转轴方向放置。轻轻倾去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品须在吸水纸不同地方沾干。 7.2.2.6加人600L75%乙醇，颠倒洗涤。于4℃条件下，12000r/min离心15min。轻轻倾去上清 液，倒置于吸水纸上，沾干液体。 7.2.2.74000r/min离心10s将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，一份样本换 用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。 7.2.2.8加入11μLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。 提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于一70℃条件下。 7.3靶核酸的反转录和扩增 7.3.1扩增试剂准备与配制 7.3.1.1、在反应混合物配制区进行。 7.3.1.2从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液、Taq酶，待反应液室温下融化后，2000r/min离心 5s。设所需PCR反应数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反 应体系需使用15uLRT-PCR反应液及0.25uLTa酶。计算各试剂的使用量，加入一试管中，向其中 7.3.2加样 7.3.2.1在样本处理区进行。 3 SAC