ICS 67.050 B 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19495.6—2004 转基因产品检测 基因芯片检测方法 Detection of genetically modified organisms and derived products- Gene-chip detection 2004-04-13发布 2004-04-13实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19495.6—2004 前 #言 GB/I19495《转基因产品检测》为系列标准： GB/T19495.1—2004 转基因产品检测 通用要求和定义； GB/T19495.22004 转基因产品检测 实验室技术要求； GB/T19495.3—2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法； GB/T19495.4—2004 转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法； ——GB/T19495.5—2004 转基因产品检测 核酸定量PCR检测方法； -GB/T 19495.6—2004 转基因产品检测 基因芯片检测方法； —GB/T19495.7—2004 转基因产品检测 抽样和制样方法； GB/T 19495.82004 转基因产品检测 蛋白质检测方法。 本部分的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录， 本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分由中华人民共和国质量监督检验检疫总局批准发布。 本部分主要起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局动植物 检疫实验所。 本部分参与起草单位：北京师范大学、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国辽 宁出入境检验检疫局、上海博星基因芯片有限责任公司。 本部分主要起草人：章桂明、黄文胜、程英豪、覃文、曹际娟、朱水芳、李瑶、缪海珍、余道坚、陈枝楠、 孙增强、谢月华。 本部分系首次发布的国家标准。 1 GB/T19495.6—2004 转基因产品检测基因芯片检测方法 1范围 GB/T19495的本部分规定了转基因产品基因芯片检测方法。 本部分适用于用基因芯片对转基因产品的筛选基因、物种结构特异性基因、品系鉴定检测基因和内 源基因等的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T19495的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 GB/T19495.12004转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T19495.2一2004转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3—2004转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T19495.4一2004转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法 GB/T19495.5—2004转基因产品检测 核酸定量PCR检测方法 GB/T19495.7-2004转基因产品检测 抽样和制样方法 3术语、定义和缩略语 本部分采用下列术语、定义和缩略语。 3.1术语和定义 GB/T19495.1确立的以及下列术语和定义适用于GB/T19495的本部分。 3. 1. 1 基片substrate 基因芯片中用于固定探针的基质，通常采用标准的“载玻片或其他固体载体”，经过化学修饰制备 而成。 3.1.2 基因芯片探针DNAmicroarrayprobe 基因芯片中固定于基质表面、能与样本DNA互补、用于探测样本DNA信息的核酸分子，本部分采 用寡核苷酸片段作探针。 3. 1. 3 定位探针positivepositionprobe 是一段与待检基因无关的寡核苷酸，通过和标记的定位探针互补链杂交显示信号，用于点样矩阵的 位置的确定。 3. 1. 4 阳性质控探针positivequalitycontrolprobe 用于样品抽提、PCR、杂交的反应体系的监控，一般用生物的管家基因来设计阳性质控探针。 1 GB/T19495.6—2004 3. 1. 5 阴性质控探针negativequalitycontrolprobe 是一段与待检基因无关的寡核苷酸，用于基因芯片非特异性杂交背景的监控。 3. 1. 6 基因芯片空白质控点noprobemicroarrayspot 由不含核酸的点样液点制而成，用于基因芯片杂交背景的监控 3. 1. 7 目标基因探针probefortargetgene 用于检测目标基因序列的探针。 3.1.8 信噪比signal noise ratio 是杂交信号值与杂交背景值的比值，由图像分析软件自动判读 3.2缩略语 下列缩略语适用于本标准。 3.2.1cy5-dCTP：cy5deoxycytidinetriphosphate，cy5标记的脱氧胞苷三磷酸。 3.2.2NSC:no sample control,空白样本对照。 3.2.3NTC:notemplatecontrol,空白模板对照。 3.2.4NC:negative control,阴性对照。 3.2.5PC:positive control,阳性对照。 4防污染措施 按照GB/T19495.2—2004的规定执行。 5抽样与制样 按照GB/T19495.7—2004的规定执行。 6原理 基因芯片技术是将探针DNA有序地固定于玻片或其他固相载体上，测试样品的核酸分子经过标 记，与固定在载体上的DNA阵列中的探针按碱基配对原理同时进行杂交，洗去未互补结合的片段。然 后通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，用计算机软件进行数据的比较 和分析，从而获取样品分子的数量和序列信息。 基因芯片技术的操作原理分为两部分：芯片的制备，样本的检测。 基因芯片的制备：根据需要检测的外源目标基因设计寡核苷酸探针，用于制备基因芯片。在制备寡 核苷酸探针时，一般在其5'，或3端进行氨基修饰，以利于其在玻片表面的固定。另外，对玻片表面进 行氨基修饰，然后在氨基修饰后的玻片表面上连接双功能偶联剂，如戊二醛（GA）或对苯异硫氰酸酯 (PDC)，制备成基片。探针合成好后，利用（通过)点样仪点在基片上，寡核苷酸的修饰氨基将与基片上 的戊二醛的另一个醛基发生化学反应，或与PDC分子的另一个异硫氰基发生类似的反应，从而达到寡 核苷酸交联固定的目的。为了有利于寡核苷酸探针分子和目标基因片段之间的杂交，通常在所设计的 寡核苷酸探针序列的5端或3端通常要加入一段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子。采用 poly(dT)10作为手臂分子。点样完成后要对芯片进行后处理，后处理的目的主要是为了使探针能与载 体表面牢固结合，同时，还对载体上未与探针结合的游离活性基团进行封闭以避免在杂交过程中非特异 性的吸附对实验结果（特别是背景）造成影响。 样本的检测：包括目标DNA的标记、杂交和结果判断等部分。测试样本（目标DNA)在酶促反应 2 GB/T19495.6—2004 中通过掺人法或引物修饰等方法进行标记。利用核酸碱基配对的性质，将标记的测试样本变性后与点 7试剂 除另有规定外，所有试剂的等级和要求应符合GB/T19495.2一2004中的规定。如未明确规定的， 试剂应是分子生物学级的。所有试剂的储存和使用应符合供应商和实验室的要求。 7.1 cy5-dCTP。 7.2点样液（0.2mol/L碳酸钠）。 7.3基因芯片洗脱液（0.2%SDS)。 7.4 基因芯片杂交液（1%SDS，10XSSPE）。 7. 5 阴性标准物质。 7.6 阳性标准物质。 7.7 琥珀酸酐溶液（0.5%琥珀酸酐，溶剂为吡咯烷酮，pH8.0）。 硼氢化钠溶液（0.2%NaBH4，溶剂为PBS）。 7. 9 Cy标记的定位探针的互补链。 8主要仪器设备 8.1 基因芯片点样仪。 8.2 紫外交联仪。 8.3基因扩增仪。 8.4基因芯片扫描仪：要配备具有分析信噪比的软件。 8.5杂交仪。 8.6清洗槽。 8.7暗室。 9检测 9.1一般性要求 附录A至附录C规定了转基因产品筛选检测、物种结构特异性检测和品系鉴定检测的基因芯片检 测方法以及各自的适用范围。 测试样品中DNA的提取，应按照GB/T19495.3一2004中的规定执行。每个测试样品提取时应做 两个提取重复。 每批测试实验需设置对照。对照的设置应符合GB/T19495.2一2004中的规定。所有对照的结果 中若有一项不符合者，测试结果应放弃并重做 9.2基因芯片检测的种类 根据测试样品的类型和（或）分析检测的要求，转基因产品的基因芯片检测分为：筛选检测、物种结 构特异性基因检测和品系特异性基因检测等 10 结果表述 未检出X××转基因成分，检测低限为×%。 检出×××转基因成分，检测低限为×%。如果进行了品系检测，则进一步报告该检测样品是 XXX转基因品系。