ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T203632006 饲料中苯巴比妥的测定 Determination of phenobarbital in feed 2006-06-09发布 2006-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20363—2006 前言 本标准系参阅国内外最新文献，经大量实验研究后结合我国现有技术装备水平，提出用高效液相色 谱（HPLC)法定量，用气相色谱-质谱（GC-MS)法仲裁。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（武汉）。 本标准主要起草人：屈利文、钱防、杨林、叶德连、钱沁。 GB/T20363—2006 饲料中苯巴比妥的测定 1范围 法，规定GC-MS法为仲裁法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中苯巴比妥的测定。HPLC法的最低检出量为 5.0ng（取样5g时，最低检测限为0.10mg/kg），GC-MS法最低检出量为0.25ng（取样5g时，最低检 测限为0.02mg/kg）。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696） GB/T14699.1饲料采样 3方法1:HPLC法 3.1原理 用三氯甲烷将饲料中的苯巴比妥溶出，经净化、萃取、浓缩后，用甲醇溶解，在HPLC仪上分离 测定。 3.2试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 3.2.1水,GB/T6682中二级 3.2.2三氯甲烷。 3.2.3甲醇。 3.2.4氢氧化钠溶液[c(NaOH)约0.45mol/LI:18g氢氧化钠溶于1000mL水中。 3.2.5磷酸：85%。 3.2.6HPLC流动相：V（水）（3.2.1）+V（乙睛）（用前过0.45μm滤膜）=65+35，用前超声脱气。 3.2.7苯巴比妥标准溶液 3.2.7.1储备液：准确称取100.00mg苯巴比妥标准品（含Cl2H2O,N2不少于98.5%）于50mL容 量瓶中，用甲醇（3.2.3）溶解，并定容至刻度，该溶液为每毫升含苯巴比妥2000ug。储于冰箱中，有效 期半年。 3.2.7.2工作液：用微量移液器移取储备液（3.2.7.1)500uL，用甲醇（3.2.3）定容于50mL容量瓶， 该溶液为每毫升含苯巴比妥20.00ug，储存于冰箱中备用。 3.2.7.3标准系列：用移液器移取工作液（3.2.7.2)1.0、2.0、5.0、10.00、15.00mL于50mL容量瓶， 以甲醇（3.2.3）稀释定容，该标准溶液系列中苯巴比妥的相应浓度为0.40、0.80、2.00、4.00、 6.00μg/mL，储存于冰箱中备用 3.3仪器与设备 3.3.1实验室常用仪器设备。 3.3.2分析天平：感量0.0001g。 1 GB/T20363—2006 3.3.3实验用振荡器。 3.3.4具塞三角瓶：100mL。 3.3.5分液漏斗：150mL。 3.3.6旋转蒸发器：带100mL、200mL梨形瓶 3.3.7高效液相色谱仪：具有C1.柱或类似的分析柱和紫外（UV)检测器或二极管阵列检测器。 3.4试样的制备 按GB/T14699.1方法采样，选取饲料样品至少500g，四分法缩减至少100g，磨碎，通过0.42mm 孔筛，混匀，装入密闭容器中，保存备用。 3.5分析步骤 3.5.1提取 称取适量试样（配合饲料5g，预混料和浓缩料2g），精确至0.0001g，置于100mL具塞三角烧瓶 中，加入25mL三氯甲烷（3.2.2）充分振摇，于振荡器上提取30min，过滤，滤渣返回瓶内，再用25ml 3.5.2净化及浓缩 移取50mL三氯甲烷提取液（3.5.1）置于200mL梨形烧瓶中，在旋转蒸发器（3.3.6）上于50℃蒸 干溶剂，残渣加10mL氢氧化钠溶液（3.2.4），充分振荡后，用磷酸（3.2.5）酸化调pH2~3后，转人分液 漏斗中，每次用10mL三氯甲烷反提取共三次，弃去水相，将三次三氯甲烷提取液转人150mL梨形烧 瓶中，于旋转蒸发器上，蒸干溶剂。 3.5.3测定 3.5.3.1溶解 于净化、蒸干溶剂的残渣试样中准确加入1.00mL～2.00mL(V)甲醇（3.2.3），充分振摇、超声，使 残渣溶解，过0.45um的滤膜，清液上机测定，用苯巴比妥标准系列（3.2.7.3进行单点或多点校准。 3.5.3.2HPLC测定参数设定 色谱柱：Ci柱，长250mm，内径3.9mm，粒度4μm，或类似的分析柱； 柱温：室温； 流动相：V（乙腈）+V（水）=35十65（见3.2.6）； 流速:1.0 mL/min; 检测器：UV检测器或二极管阵列检测器； 检测波长：210nm； 进样量：20μL~50μL。 3.5.3.3定性、定量方法 定性方法：除用保留时间定性外，还可用二极管阵列检测器测定苯巴比要紫外光区的特征光谱。试 样的特征光谱应与标准品的特征光谱一致（在相同的保留时间处）。 定量方法：积分记录峰面积，用单点或多点校准法定量。 3.6分析结果的表述 3.6.1试样中苯巴比妥的含量按式（1)计算： ....(1) m250 式中： X—一试样中苯巴比妥的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； HPLC色谱峰的面积对应的苯巴比妥的质量，单位为微克（μg）； 所称取的试样质量（3.5.1)，单位为克（g)； m2 V- 溶解残渣的总体积，单位为毫升（mL）。 2 GB/T20363—2006 3.6.2每个试样取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果，保留三位有效数字。 3.7重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的20%， 以大于这两个测定值的算术平均值的20%情况不超过5%为前提。 4方法2：GC-MS法（仲裁法） 4.1原理 用三氯甲烷将饲料中的苯巴比妥溶出，经净化、萃取、浓缩后，在GC-MS联用仪上分离、测定。 4.2试剂和材料 4.2.1提取净化用试剂 同HPLC法中3.2.1~3.2.5。 4.2.2苯巴比妥标准溶液 4.2.2.1储备液:2000μg/mL,同HPLC法中3.2.7.1。 4.2.2.2工作液:20.00μg/mL,同HPLC法中3.2.7.2。 4.2.2.3标准系列：用微量移液器分别移取工作液（4.2.2.2)125、250、500、1000、2500L于10mL 容量瓶中，用甲醇（3.2.3)稀释定容，该标准系列中苯巴比妥的相应浓度分别为：0.25、0.50、1.00、2.00、 5.00μg/mL，贮于冰箱中备用。 4.3仪器、设备 4.3.1样品前处理设备同HPLC法3.3.1~3.3.6。 4.3.2GC-MS联用仪：装有弱极性或非极性的交联毛细管柱的气相色谱仪和具电子轰击离子源及检 测器。 4.4试样制备 同3.4。 4.5分析步骤 4.5.1提取 同3.5.1。 4.5.2净化及浓缩 同3.5.2。 4.5.3测定 4.5.3.1溶解 同3.5.3.1。 4.5.3.2GC-MS测定参数设定 色谱柱：弹性石英键合相毛细管色谱柱SE-54，长30m，直径0.25mm，壁厚0.25μm； 载气：氨气（99.999%）； 柱头压：100kPa； 进样口温度：260℃； 进样量：1uL不分流； 柱温程序：120℃保持1min，以20℃/min的速度升至260℃，于260℃保持15min； EI源电子轰击能：70eV； 离子源温度：200℃； 接口温度：250℃； 质量扫描范围：60AMU~250AMU； 溶剂延迟：2min;