ICS 67.100 C 53 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T 22388—2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法 Determination of melamine in raw milk and dairy products 2008-10-07发布 2008-10-07实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22388—2008 前言 本标准包括三个方法：第一法高效液相色谱法，第二法液相色谱-质谱/质谱法，第三法气相 色谱-质谱联用法。检测时，应根据检测对象及其限量的规定，选用与其相适应的检测方法。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国食品安全应急标准化工作组、全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会提 出并归口。 本标准第一法起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国疾病预防控制中心、国家食品质量安全监 督检验中心、北京市疾病预防控制中心、国家乳制品质量监督检验中心、浙江省质量技术监督检测研究 院、国家加工食品质量监督检验中心（广州）。 本标准第一法主要起草人：宋书锋、鲁杰、安娟、杨大进、李淑娟、张晶、刘艳琴、杨红梅、杨金宝、 鄂来明、廖上富、陈小珍、蔡依军、郭新东、吴玉銮。 本标准第二法起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心、国家食品质量安全 监督检验中心、中国疾病预防控制中心、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准第二法主要起草人：彭涛、吴永宁、邵兵、王浩、李晓娟、郭启雷、苗虹、赵云峰、丁涛、李立、 蒋原。 本标准第三法起草单位：上海市质量监督检验技术研究院、国家食品质量安全监督检验中心、中国 检验检疫科学研究院。 本标准第三法主要起草人：巢强国、常宇文、雷涛、陈冬东、赵玉琪、周耀斌、穆同娜、葛宇、曹程明、 张辉、麦成华、曹红。 SAC I GB/T22388—2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法 1范围 （HPLC法）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS法）和气相色谱-质谱联用法［包括气相色谱-质谱法 （GC-MS法），气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS法）]。 本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定；液相色谱-质谱/质谱法、气相 色谱-质谱联用法（包括气相色谱-质谱/质谱法）同时适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的 定性确证。 本标准高效液相色谱法的定量限为2mg/kg，液相色谱-质谱/质谱法的定量限为0.01mg/kg，气 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD 3第一法高效液相色谱法（HPLC法） 3.1原理 试样用三氯乙酸溶液-乙睛提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法 定量。 3.2试剂与材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 3.2.1甲醇：色谱纯。 3.2.2乙腈：色谱纯。 3.2.3多 氨水：含量为25%~28%。 3.2.4三氯乙酸。 3.2.5柠檬酸。 3.2.6辛烷磺酸钠：色谱纯。 3.2.7甲醇水溶液：准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用。 3.2.8 三氯乙酸溶液（1%）：准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后 备用。 3.2.9氨化甲醇溶液（5%）：准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。 3.2.10离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加人约980mL水溶解，调 节pH至3.0后，定容至1L备用。 3.2.11三聚氰胺标准品：CAS108-78-01，纯度大于99.0%。 3.2.12三聚氰胺标准储备液：准确称取100mg（精确到0.1mg）三聚氰胺标准品于100mL容量瓶 中，用甲醇水溶液（3.2.7）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光 保存。 1 GB/T22388—2008 3. 2. 13 阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯 基苯高聚物，填料质量为60mg，体积为3mL，或相当者。使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化。 3.2.14定性滤纸。 3.2.15 3.2. 16 微孔滤膜：0.2um，有机相。 3.2. 17 氮气：纯度大于等于99.999%。 3.3仪器和设备 3.3.1高效液相色谱（HPLC)仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 3.3.2 分析天平：感量为0.0001g和0.01g。 3. 3. 3 离心机：转速不低于4000r/min。 3.3.4 超声波水浴。 3.3.5固相萃取装置。 3.3.6 氮气吹干仪。 3.3.7 涡旋混合器。 3.3.8具塞塑料离心管：50mL。 3.3.9研钵。 3.4样品处理 3.4.1提取 3.4.1.1液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等 称取2g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加人15mL三氯乙酸溶液（3.2.8）和 5mL乙睛，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯 乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待 净化液。 3.4.1.2奶酪、奶油和巧克力等 称取2g（精确至0.01g）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4倍～6倍）研磨成干粉状，转 移至50mL具塞塑料离心管中，用15mL三氯乙酸溶液（3.2.8）分数次清洗研钵，清洗液转离心管 中，再往离心管中加人5mL乙睛，余下操作同3.4.1.1中“超声提取10min，加入5mL水混匀后 做待净化液”。 注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正已烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。 3.4.2净化 将3.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱（3.2.13)中。依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近 干后，用6mL氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50℃ 后，供HPLC测定。 3.5高效液相色谱测定 3.5.1HPLC参考条件 色谱柱：C柱，250mm×4.6mml内径（i.d.）],5μm，或相当者。 a) Cis柱，250mm×4.6mml内径（i.d.）]5μm，或相当者。 s2cb) 流动相：C柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙睛（85十15，体积比），混勾。 Ci柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙睛（90十10，体积比），混匀。 流速:1.0 mL/min。 d）柱温：40℃。 e） 波长：240nm。 2 GB/T22388—2008 f）进样量：20μL。 3.5.2标准曲线的绘制 用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80ug/mL的标准工作液， 浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品 HPLC色谱图参见附录A中的图A.1。 3.5.3定量测定 待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。 3.5.4结果计算 试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1)计算获得： .(1) A,XmX1000 式中: X试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 样液中三聚氰胺的峰面积； 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V—样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； A。标准溶液中三聚氰胺的峰面积； m——试样的质量，单位为克（g）； —稀释倍数。 3.6空白实验 除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。 3.7方法定量限 本方法的定量限为2mg/kg。 3.8回收率 在添加浓度2mg/kg～10mg/kg浓度范围内，回收率在80%~110%之间，相对标准偏差小 于10%。 3.9允许差 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 4第二法液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS法） 4.1原理 试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确 证，外标法定量。 54.2试剂与材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.2.1乙酸。 4.2.2乙酸铵。 4.2.3乙酸铵溶液（10mmol/L）：准确称取0.772g乙酸铵于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度， 混匀后备用。 4.2.4其他同3.2。 4.3仪器和设备 4.3.1液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS)仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 4.3.2其他同3.3。 3