ICS 11.220 B 41 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T22916—2008 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法 Protocol of fluorogenic RT-PCR for vesicular stomatitis virus 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 22916—2008 前言 本标准参考了世界动物卫生组织（OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》 （第5版）。 本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：花群义、周晓黎、曾少灵、曹琛福、詹爱军、张彩虹、林庆燕、陈兵、杨云庆、孙洁。 GB/T22916—2008 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的操作方法 本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 2.1荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 2.2 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 2.3 RNA 核糖核酸。 2.4DEPC 焦碳酸磷酯。 2.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水（配方见附录A）。 2. 6 TaqDNA聚合酶。 2.7 VSV 水泡性口炎病毒。 3原理 水泡性口炎病毒属RNA病毒，根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列，合成一对特异性引 物和一条特异性的荧光双标记探针。通过严格设计和筛选的引物和探针，涵盖水泡性口炎病毒的两个 型和突变株，为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针。探针的5'端标记FAM荧光素，它发出的荧 光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团；3端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5'端报告 荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。在扩增时，Taq酶发挥它的5'→3端外切核酸酶的功 能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，标记在探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团均游离于溶液 中，仪器检测到发出的荧光信号。 SZIC 4材料与试剂 4.1 仪器与器材 4.1.1荧光RT-PCR检测仪 4. 1. 2 高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。 4. 1.3 台式离心机（离心速度3000r/min）。 4. 1. 4 ：混匀器。 4. 1. 5 冰箱（2℃～8℃和一20℃两种）。 4. 1. 6 微量可调移液器（5μL，10μL，100μL，1000μL）及配套带滤芯吸头 1 GB/T22916—2008 4.1.7Eppendorf管(1.5mL)、透明薄壁PCR管（0.2mL)。 4.2试剂 4.2.1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC 水处理后高压灭菌)分装。 4.2.2三氯甲烷。 4.2.3异丙醇：一20℃预冷。 4.2.4PBS:配方见附录A。 4.2.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20C预冷。 4.2.6水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项参见附录B。 4.2.7引物：上游引物为5'-ATGGCTCCTACAGTTAAGAGAATCA-3'，下游引物为5-TGAAG TAATCAGCCGGGTATTC-3'。 4.2.8荧光双标记探针（10μmol/L）：(FAM)5'-CGAAATTACCGGCCAACGAGGATC-3（TAM AR）。扩增目标片段长度为97bp。 5抽样 5.1采样工具 5.1.1下列采样工具应经121℃土2℃,15min高压灭菌并烘干。 5.1.2棉拭子。 5.1.3剪刀、镊子。 5.1.4注射器。 5.1.51.5mL Eppendorf 管。 5.1.6研钵。 5.2样品采集 5.2.1采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液、口腔分泌物和组织。采集后立 即冷藏送检或放入含抗生素的PBS缓冲液中于4℃环境中保藏。编号并作好记录。 5.2.2水泡液及水泡皮：只有当水泡完整时才能采集到水泡液。水泡一旦出现很快就会破溃，所以要 精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓冲液灭菌瓶中。 5.2.3水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放人含抗生素的PBS缓冲液中。若水泡已经破溃，则 只能采集破溃的水泡皮，用灭菌生理盐水涮洗掉水泡皮上的污物，放入上述缓冲液中。 5.2.4口腔分泌物和咽喉拭子：用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮3次～5次取分泌 液，拭子一并放人盛有1.0mL含抗生素的PBS缓冲液的1.5mLEppendorf管中。也可用食道探杯刮 取咽喉液体，放人加有抗生素的PBS中。编号，冷藏送检或低温保藏。 5.2.5血液：用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendorf管中，密封、编号后保存于4C环 境中送检。 5.2.6肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，冷藏送检或低 温保藏。 5.3样品贮运 封，送实验室。 5.4样品制备 5.4.1水泡液、口腔分泌物、血液和精液 样品在混勾器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转 2 GB/T22916—2008 人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 5.4.2水泡皮、肌肉或组织脏器 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4℃下以3000r/min 离心15min，取上清液转人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 5.5样本存放 复冻融（冻融不超过三次）。 6操作方法 6.1实验室要求 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混 合物配制区和检测区；各工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用：每一区域应有 专用的仪器设备；进人各个工作区域应严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物 配制区至检测区。 6.2样本的处理 6.2.1在样本制备区进行。样品中总RNA提取的试剂盒，有商品化试剂盒出售，也可自行配制 6.2.2取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和（阳 性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），编号。 6.2.3每管加人600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，一份样本换用一 个吸头，再加人200μL三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用 手颠倒混匀）。于4℃以12000r/min离心15min。 5ZIC 6.2.4取与6.2.2相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加人500μL异丙醇（一20℃预冷），做标记。 吸取6.2.3各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μuL，不能吸出中间层，颠倒 混匀。 6.2.5于4℃、以12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒 倒洗涤。 6.2.6于4℃以12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒 去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方活干）。 6.2.7以4000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液 体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀 一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。 6.2.8各管加人11μLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以2000r/min离心5s，冰上保存备 用。提取的RNA应在2h内进行PCR扩增；若需长期保存应放置于一70℃冰箱内。 6.3检测 6.3.1扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化 后，以2000r/min离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n（n=u十2+1)，其中u为被检样品数、2 为阳性对照数、1为阴性对照数，每个样品测试反应体系配制见表1。 3