ICS 11.220 B 41 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 22917—2008 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法 Protocol of fluorogenic RT-PCR for swine vesicular disease virus 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 22917—2008 前言 本标准参考了世界动物卫生组织（OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》 （第5版）。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：花群义、卢体康、吕建强、阮周曦、杨云庆、周晓黎、杨素、董俊、陈书琨 GB/T 22917—2008 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测的操作方法 本标准适用于动物及其产品中猪水泡病病毒的检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 2.1荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 2.2 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 2.3 RNA 核糖核酸。 2.4DEPC 焦碳酸磷酯。 2.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水，配方见附录A。 2. 6 Taq DNA聚合酶。 2.7 SVDV 猪水泡病病毒。 3原理 根据猪水泡病病毒的基因特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。引物 和探针通过严格的设计和筛选，涵盖已报道的所有猪水泡病病毒的毒株。荧光探针的5'端标记FAM 荧光素，3'端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号。扩增时， 由于Taq酶的5'-→>3'的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信 号产生。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。 4材料与试剂 4.1仪器与器材 4.1.1荧光RT-PCR检测仪 4. 1. 2 高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。 4.1.3台式离心机或手掌式离心机（离心速度3000r/min）。 4.1.4混匀器。 4.1.5冰箱（2℃~8℃和-20℃两种）。 4. 1. 6 ：微量可调移液器（5μL，10μL，100μL，1000μL）及配套带滤芯吸头 4. 1. 7 1.5mL、0.5mL硅化Eppendorf管：将Eppendorf管和滴头浸泡于含有0.1%DEPC的三蒸水 中过夜，121℃土2℃高压灭菌15min，40℃烘干备用。市售Eppendorf管和滴头已经硅化，可直接 1 GB/T22917—2008 使用。 4. 1. 8 30.2mL透明薄壁PCR管。 4.1.96×6孔或5×8孔冰盒。 4. 1. 10 水浴锅：0℃~100℃。 4.1.11旋涡振荡器。 4.2试剂 4.2.1本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭 菌)分装。 4.2.2三氯甲烷。 4.2.3异丙醇：-20℃预冷。 4.2.4 PBS：配制方法见附录A。 4.2.5 ：75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷 4.2. 6 裂解液：配制方法见附录A。 4.2.7 酚（分析纯）。 4.2.8 无水乙醇（分析纯）。 4. 2. 9 AMV反转录酶（5U/μL）：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.2. 10 dNTPs:含 dCTP,dGTP,dATP、dTTP 各 10 mmoL/L。 4.2. 11 RNA酶抑制剂（RNasin，40U/μL)：一20C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化 4.2.12 TaqDNA聚合酶（5U/μL）：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化 4.2.13 反转录和PCR缓冲液（5X）：配制方法见附录A。 4.2.14 氯化镁（25mmol/L）。 4.2.15 引物（15umol/L）：上游引物5'-GGCAACGCATACAGCATGTT-3'；下游引物5-GCCG TATGTCCCTTGCTTGT-3'。 4.2.16 6荧光双标记探针（10μmol/L）：（FAM)5-TATGACGGGTGGGCCAGGTT-3（TAMRA）。 4.2.17DEPC处理水：按0.1%加入DEPC，摇匀，室温静置过夜，121℃C士2C高压灭菌20min，冷却 备用。 5抽样 5.1采样工具 5.1.1下列采样工具应经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干。 5.1.2棉拭子。 5.1.3 剪刀、镊子。 5. 1. 4 ，注射器。 5.1.5 1.5mLEppendorf管。 5.1.6 研钵。 5. 1.7 真空采血管。 3记号笔。 5. 1. 8 5.1.9低温保藏箱或冰盒。 5.2样品采集 5.2.1采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液、口腔分泌物和组织。采集后立 即冷藏送检或置于含抗生素的PBS缓冲液中4℃环境下保藏。编号并作好记录。 去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓 2 GB/T 22917—2008 冲液灭菌瓶中。水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放人含抗生素的PBS缓冲液中。 5.2.3口腔分泌物和咽喉拭子：用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮3次～5次取分泌 液，拭子一并放人盛有1.0mL含抗生素的PBS缓冲液的1.5mLEppendorf管中。也可用食道探杯刮 取咽喉液体，放人加有抗生素的PBS中。编号，冷藏送检或低温保藏。 5.2.4血液：用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendorf管中，密封、编号后保存于4℃环 境中送检。 温保藏。 5.3样品贮运 样品采集后，放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放入一个塑料袋内），于保温箱中加冰、密 封，送实验室。 5.4样品制备 5.4.1水泡液、血液和口腔分泌物 样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转 人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 5.4.2水泡皮、肌肉或组织脏器 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4℃下以3000r/min 离心15min，取上清液转人无菌的1.5mlEppendorf管中，编号备用。 5.5样本存放 制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反复 冻融（冻融不超过三次）。 6操作方法 6.1实验室要求 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测的实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合 物配制区和检测区；各工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用；每一区域应有专 用的仪器设备；进入各个工作区域应严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配 制区至检测区。 6.2样本的处理 6.2.1在样本制备区进行。样品中总RNA提取的试剂盒，有商品化试剂盒出售，也可自行配制 6.2.2取n个灭菌的1.5mLEppendorf管,其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和， 编号。 6.2.3每管加人600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，一份样本换用一 个吸头，再加入200L三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用 手颠倒混匀）。于4℃以12000r/min离心15min。 6.2.4取与6.2.2相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加人500μL异丙醇（一20℃预冷），做标记。 吸取6.2.3各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒 混匀。 6.2.5于4℃、以12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒 去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；加入600μL75%乙醇，颠 倒洗涤。 6.2.6于4℃、以12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒 去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）。 3