ICS 67.050 x 04 中华人民共和国国家标准 GB/T22944—2008 蜂蜜中克伦特罗残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of clenbuterol residues in honey- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22944—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 本标准主要起草人：曹彦忠、石玉秋、贾光群、姚智慧、刘晓茂、庞国芳。 GB/T22944—2008 蜂蜜中克伦特罗残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了蜂蜜中克伦特罗残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于蜂蜜中克伦特罗残留量的测定。 本标准的方法检出限为1μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.22004，ISO5725-2：1994，IDT） 3原理 蜂蜜中残留的克伦特罗用乙酸钠缓冲溶液（pH=5.0)提取，过滤后，经OasisHLBl或相当的固相 萃取柱净化，用氨水甲醇溶液洗脱并蒸干，残渣用甲醇-0.1%甲酸溶液溶解，过0.2um滤膜后，样品溶 液供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量 4试剂和材料 4.1水:GB/T6682,一级。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙腈：色谱纯。 4.42 乙酸钠：优级纯。 4.5冰乙酸：优级纯。 4.6氨水：分析纯。 4.7甲酸：优级纯。 4.80.2mol/L乙酸钠缓冲溶液：称取16.4g乙酸钠（4.4），放入1000mL烧杯中，加人800mL水溶 解，用冰乙酸（4.5）调至pH值为5.0，再用水定容至1000mL。 4.9氨水-甲醇溶液（1+19)：吸取5mL氨水（4.6)与95mL甲醇（4.2)混合均匀。 4.10甲醇溶液（3+7)：量取30mL甲醇与70mL水混合均匀。 4.110.1%甲酸溶液：吸取1.0mL甲酸（4.7），用水稀释至1000mL。 4.12甲醇-0.1%甲酸溶液（1+19）。量取5mL甲醇与95mL0.1%甲酸溶液（4.11)混合。 4.13 3克伦特罗标准物质（CAS37148-27-9）：纯度≥95%。 1）OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 1 GB/T22944—2008 4.141.0mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的克伦特罗标准物质（4.13），用甲醇配成1.0mg/mL 的标准储备溶液。该溶液在4℃保存。 4.151.0μg/mL标准工作溶液：吸取0.1mL标准储备溶液（4.14）放人100mL容量瓶中，用甲醇稀 释至刻度。该溶液在4℃保存 4.16内标物质：克伦特罗-D9，纯度≥99% 4.171.0mg/mL内标储备溶液：准确称取适量克伦特罗-D9标准物质（4.16），用甲醇配成 1.0mg/mL内标贮备溶液。该溶液于4℃保存。 4.181.0μg/mL内标工作溶液：吸取0.1mL内标储备溶液（4.17)放人100mL容量瓶中，用甲醇稀 释至刻度。该溶液在4℃保存 4.19基质标准工作溶液：吸取不同体积标准工作溶液（4.15）和20L内标工作溶液（4.18），用空白样 品提取液配成1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL不同浓度的基质标准工 作溶液。当天配制。 4.20OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。用前依次用6mL甲醇和10mL水活化。保 持柱体湿润。 4.21滤膜：0.2μm。 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2固相萃取装置。 5.3 氮气浓缩仪。 5.4 液体混匀器。 5.5分析天平：感量0.1mg，0.01g。 5.6 真空泵：最大负压80kPa。 221 5.7pH计：测量精度±0.02。 5.8玻璃贮液器：50ml。 5.9吹干管：10mL。 6试样制备与保存 6.1试样的制备 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴 中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶 中，密封，并做上标记。 6.2试样的保存 将试样于常温下保存。 7测定步骤 7.1提取 称取2g试样，精确至0.01g。置于150mL三角瓶中，加入20mL乙酸钠缓冲溶液（4.8），加人 20μL内标工作溶液（4.18），于液体混匀器（5.4）上快速混匀1min，使试样完全溶解。 7.2净化 将塞有玻璃棉的玻璃贮液器（5.8）连到OasisHLB或相当的固相萃取柱（4.20）上，把样液倒人玻 璃贮液器中，调节流速小于3mL/min，使样液通过OasisHLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用 5mL水和5mL甲醇溶液（4.10）洗柱，弃去全部流出液。固相萃取柱减压抽干30min，然后用5mL氨 2 GB/T22944—2008 水-甲醇溶液（4.9）洗脱，收集洗脱液于10mL吹干管（5.9）中。在50C水浴用氮气浓缩仪吹干。准确 加入1.0mL甲醇-0.1%甲酸溶液（4.12)溶解残渣，过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。 按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液。 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 a) 色谱柱：AtlantisC8，3μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； b) 柱温：40C； c) 流速；0.2mL; d) 进样量：20μL； e) 流动相：A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件见表1。 表1梯度洗脱条件 时间/min A /% B /% 0.00 5.0 95.0 80.0 20.0 8.00 8.01 95.0 5.0 11.00 5.0 95.0 7.3. 2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测； d) 电喷雾电压：5500V； e) 雾化气压力：0.083MPa； f) 气帘气压力：0.069MPa； g) 辅助气流速：6L/min； h) 离子源温度：500℃； ) 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表2。 表2定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压 定性离子对 定量离子对 碰撞气能量/ 去簇电压/ 化合物中文名称 化合物英文名称 (m/z) (m/z) V v 277/203 20 克伦特罗 clenbuterol 277/203 20 277/259 14 7.4液相色谱-串联质谱测定 7.4.1定性测定 被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与 标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标 准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对 应的待测物。 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 相对离子丰度K K>50 10<K<20 20<K<50 K≤10 允许最大偏差 ±20 ±25 ± 30 ± 50 3