ICS 65.140 B 47 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 23195—2008 蜂花粉中过氧化氢酶的测定方法 紫外分光光度法 Method for the determination of catalase in bee pollen- Ultaraviolet spectrophotometry 2008-12-31发布 2009-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23195—2008 前言 本标准由中华全国供销合作总社提出并归口。 本标准起草单位：广州市宝生园有限公司、华南农业大学。 本标准主要起草人：郑尧隆、刘伟、陈伟彬。 GB/T23195—2008 蜂花粉中过氧化氢酶的测定方法 紫外分光光度法 1范围 本标准规定了蜂花粉中过氧化氢酶的测定方法。 本标准适用于蜂花粉中过氧化氢酶的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度在一定范 围内随反应时间而降低，根据测量吸光度的变化速度即可测定过氧化氢酶的活性。 4试剂 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682要求的蒸馏水或去离子水 4.1磷酸缓冲液：pH为6.8~7.0,浓度为50mmol/L，含有1mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）。 准确称取17.91gNazHPO·12HzO加蒸馏水溶解并稀释至500mL，作为A液； 准确称取7.80gNaH,PO，·2H,O加蒸馏水溶解并稀释至500mL，作为B液； 准确量取55.0mLA液与45.0mLB液于200mL烧杯中，加人0.07gEDTA，加蒸馏水稀释混 匀（加至150mL左右），用酸度计标定至6.8～7.0，转入200mL容量瓶中，定容至刻度，混匀。 4.2过氧化氢溶液：体积分数为0.1%。 准确吸取0.5mL30%过氧化氢置于50mL棕色容量瓶中，用磷酸缓冲液（4.1)定容至刻度，混匀， 从中准确量取10.0mL于100mL三角锥瓶（避光）中，再准确量取20.0mL的磷酸缓冲液（4.1）加人混 匀即得。 4.3液氮。 5仪器设备 5.1紫外分光光度计。 5.2冷冻离心机。 5.3恒温水浴锅。 5.4酸度计。 5.5分析天平：感量0.1mg。 5.6移液枪：100μL，5000μL。 6待测液的制备 称取1g样品，精确到1mg，置于已用适量液氮预冷的瓷研钵中，边加液氮边研磨，待样品充分研 1 GB/T23195—2008 磨后，静置至研钵解冻升温后加人约10mL新鲜配制的磷酸缓冲液（4.1）溶解，转入25mL容量瓶中， 并用磷酸缓冲液冲洗研钵数次，合并洗液并定容至刻度。混合均匀后将容量瓶置4℃冰箱中静置 7分析步骤 7.1紫外分光光度计参数为：方式：时间扫描；波长：240nm；测定时间：120s读数间隔：5s。 7.2将样液及过氧化氢溶液（4.2)分别置于40℃恒温水浴锅中10min，准确吸取样液0.1mL于石英 皿中，将石英皿放回槽中（未放石英血前仪器已消零），再准确吸取2.9mL过氧化氢溶液（4.2)加入石 英皿中，混合均匀，立即开始读数 7.3从0s～90s中截取线性较好的1min，计算其吸光度差值。 8计算与表述 以1min内过氧化氢在240nm波长下吸光度减少0.01的酶量为1个酶活单位（U）。过氧化氢酶 活性(U/g)按式(1)计算。 AAXVI 过氧化氢酶活性 ..(1) 0.01XtxV,Xm 式中： △A—一结果中选取的1min吸光度差值； Vi———样液总体积，单位为毫升（mL）； 0.01-—240nm波长下吸光度每下降0.01为1个酶活单位（U）； 1 min; V2 测定用样液体积，单位为毫升（mL）； 样品质量，单位为克（g）。 计算结果表示到整数位，报告结果为平行测定结果的算术平均值。 9 允许差 同一实验室平行测定或重复测定结果相对标准偏差≤10%。 2 GB/T23195—2008 磨后，静置至研钵解冻升温后加人约10mL新鲜配制的磷酸缓冲液（4.1）溶解，转入25mL容量瓶中， 并用磷酸缓冲液冲洗研钵数次，合并洗液并定容至刻度。混合均匀后将容量瓶置4℃冰箱中静置 7分析步骤 7.1紫外分光光度计参数为：方式：时间扫描；波长：240nm；测定时间：120s读数间隔：5s。 7.2将样液及过氧化氢溶液（4.2)分别置于40℃恒温水浴锅中10min，准确吸取样液0.1mL于石英 皿中，将石英皿放回槽中（未放石英血前仪器已消零），再准确吸取2.9mL过氧化氢溶液（4.2)加入石 英皿中，混合均匀，立即开始读数 7.3从0s～90s中截取线性较好的1min，计算其吸光度差值。 8计算与表述 以1min内过氧化氢在240nm波长下吸光度减少0.01的酶量为1个酶活单位（U）。过氧化氢酶 活性(U/g)按式(1)计算。 AAXVI 过氧化氢酶活性 ..(1) 0.01XtxV,Xm 式中： △A—一结果中选取的1min吸光度差值； Vi———样液总体积，单位为毫升（mL）； 0.01-—240nm波长下吸光度每下降0.01为1个酶活单位（U）； 1 min; V2 测定用样液体积，单位为毫升（mL）； 样品质量，单位为克（g）。 计算结果表示到整数位，报告结果为平行测定结果的算术平均值。 9 允许差 同一实验室平行测定或重复测定结果相对标准偏差≤10%。 2