ICS 67.050 X 04 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T22982—2008 牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、 二甲硝唑及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of metronidazole,ronidazole,dimetridazole residues in milk and milk powder- LC-MS-MS method 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22982—2008 前言 本标准的附录A、附录 B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：王凤池、艾连峰、郭春海、段文仲、陈瑞春、吕红英、窦彩云、马育松、庞国芳。 GB/T22982—2008 牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、 二甲硝唑及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的高效液相色谱-串联 质谱测定方法。 本标准适用于牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的测定和确证。 本标准的方法检出限：牛奶中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑为0.5ug/kg，羟基甲硝唑为1ug/kg， 1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑为2.5μg/kg；奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑为2.5μg/kg，羟基甲硝 唑为5μg/kg，1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑为12.5μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1一 2004,ISO 5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2：1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987.MOD） 3原理 用乙睛-乙酸乙酯提取试样中的分析物，阳离子固相萃取柱净化，高效液相色谱-串联质谱测定，内 标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为液相色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙腈。 4.2乙酸乙酯。 4.3甲醇。 4.4丙酮。 4.5 乙酸。 4.6氨水。 4.7 无水硫酸钠，分析纯：经650℃灼烧4h，置于干燥器内备用。 4.8每 氨水-乙睛（1十19）：量取5mL氨水，用乙睛定容至100mL 4.9标准品：甲硝唑（metronidazole，CAS：13182-89-3）、洛硝哒唑（ronidazole，CAS：7681-76-7）、二甲 硝唑（dimetridazole，CAS:551-92-8）、羟基甲硝唑（metronidazole-OH,CAS：7681-76-7）、1-甲基-2-羟甲 基-5-硝基咪唑（hydroxydimetridazole，CAS：936-05-0）、氛代洛硝哒唑（RNZ-D3）、氛代羟基甲硝哒唑 （MZNOH-D2）和氛代1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑（HMMNI-D3）：纯度均大于等于98%。 1 GB/T229822008 4.10标准储备液：分别精确称取适量标准品，用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液。 4.11混合标准中间工作液：取标准储备液各1mL至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混 合标准工作液，浓度为1ug/mL。 4.12内标标准储备溶液：称取适量氙代内标标准品，用甲醇溶解成浓度为200ug/mL储备液。 4.13内标混合标准中间工作液：量取适量标准储备液（4.12），用甲醇定配制成内标混合标准中间工作 液，浓度为1μg/mL。 4.14滤膜：0.45μm。 4.15阳离子固相萃取柱：500mg，3mL,使用前依次用3mL甲醇、3mL乙酸乙酯活化。 5仪器和设备 5.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。 5.2离心机。 5.3分 分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.4旋涡混和器。 5.5旋转蒸发仪。 5.6氮吹仪。 5.7固相萃取装置。 6试样的制备与保存 6.1牛奶 取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封置4℃下保存，并标明标记 6.2奶粉 取均匀样品约250g装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。 7测定步骤 7.1提取 牛奶样品称取5g（准确至0.01g）于50mL具塞离心管中，奶粉样品称取1g（准确至0.01g）并加 人5mL水，往称取好的样品中加人25μL100ng/mL内标混合液，混匀。 在称取好样品离心管中首先加人5mL乙晴以沉淀蛋白，然后再加入20mL乙酸乙酯，振荡提取 2min后，3000r/min离心10min，移取上清液并通过5g无水硫酸钠过滤至鸡心瓶中。再用20mL 乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。 7.2净化 将提取液于45℃下旋转蒸发至约2mL左右，然后转移到已活化的固相萃取柱上，再用5mL乙酸 乙酯洗涤鸡心瓶两次，洗液一并转移到固相萃取柱上，以小于2mL/min流速滴下。接着依次用3mL 丙酮，3mL甲醇，2mL氨水-乙睛（5十95）淋洗，最后用5mL氨水-乙腈（5十95）洗脱并收集（此过程流 速小于2mL/min）。洗脱液在45C水浴上用氮气小心吹至近干，用水定容至1mL，涡漩混合后，过 0.45μm滤膜供HPLC-MS-MS分析。 7.3空白基质溶液的制备 将取牛奶阴性样品5g，奶粉阴性样品1g（精确到0.01g），按7.1和7.2操作。 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： a）色谱柱：Cis，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者； 2 GB/T 22982—2008 b) 色谱柱温度：30℃； 进样量：15μL； c) d) 流动相梯度及流速见表1。 表1 液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 流速/(μL/min) 0.1%乙酸水溶液/% 乙腈/% 0. 00 200 80 20 6.00 200 65 35 8.00 200 65 35 8.10 200 80 20 10. 0 200 80 20 7.4.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 离子化模式：电喷雾正离子模式（ESI+）； b) 质谱扫描方式：多反应监测（MRM）； c) 鞘气压力：104kPa； d) 辅助气压力：138kPa； e) 正离子模式电喷雾电压 (IS):4 000 V; f) 毛细管温度：320℃； g) 源内诱导解离电压：10V； h) Q1为0.4，Q3为0.7； i) 碰撞气：高纯氩气； j) 碰撞气压力：0.2Pa； k) 参考保留时间、监测离子对和裂解能量见表2。 表 2 被测物的参考保留时间、监测离子对和裂解能量 化合物名称 保留时间/min 检测离子对(m/) 裂解能量/eV 188.04/122.96* 13 羟基甲硝唑 3.74 188.04/125.94 18 158.06/140.01* 12 1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑 4.82 158.06/112.05 19 172.09/128.00° 15 甲硝唑 4.79 172.09/82.03 25 12 201.05/139.988 洛硝哒唑 5.76 201.051/110,0 17 142.07/96.03* 16 二甲硝唑 6. 43 142.07/81.03 29 氛代羟基甲硝哒唑 3.74 190.05/124.97 12 氛代1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑 4.82 161.06/143.00 13 氛代洛硝哒唑 4.79 11 204.04/143.00 a为定量离子对，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳 3