ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T22958—2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素 残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 Determination of canthaxanthin residues in fugu,eel and baked eel- HPLC-UV method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22958—2008 前言 本标准的附录A、附录 B、附录 C为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国青海出入境检验检疫 局和中华人民共和国福建出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：薄海波、星玉秀、余孔捷、贾光群、曹彦忠、離丽丽、贾红卫、庞国芳 5 GB/T22958—2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素 残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 SAC 1范围 本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素（canthaxanthin）残留量的液相色谱-紫外检测方法和液 相色谱-串联质谱确证方法。 本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素残留量的测定和确证。 本方法的检出限为0.05mg/kg 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2:1994,IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 试样中的角黄素用乙提取，正已烷脱脂净化，高效液相色谱-紫外检测，外标法定量。高效液相色 谱-串联质谱法确证。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。 4.1水:GB/T6682，一级。 4.2乙睛：色谱纯。 4.3正已烷：色谱纯。 4.4乙睛饱和的正已烷：取少量乙睛（4.2)加人正已烷（4.3）中，充分混匀。静止分层后，取用上层正 已烷。 4.5甲酸：优级纯。 4.6无水硫酸钠：用前在650℃灼烧4h，置于干燥器中冷却后备用。 4.7焦性没食子酸。 4.80.1%甲酸：移取1ml甲酸（4.5），以水定容1L。当天配制。 4.9角黄素标准物质（CAS：514-78-3）：纯度≥95%。 50mL棕色容量瓶中并定容至刻度。该溶液浓度为100ug/mL。储备液贮存在一18℃冰柜中。 4.11标准中间溶液：吸取1.00mL标准储备溶液（4.10），移人10mL棕色容量瓶中，用乙睛定容，该 1 GB/T22958—2008 溶液浓度为10μg/mL。4℃冰箱中保存。 4.12标准工作溶液：吸取一定量标准中间溶液（4.11），用流动相稀释至所需浓度。使用前配制。 4.13滤膜：0.2μm。 5仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器。 5.2 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI源）。 5.3 分析天平：感量0.1mg和0.01g各一台。 5. 4 旋涡混匀器。 5.5 离心机：5000r/min。 5.6 移液器：1mL。 5.7 聚丙烯离心管：50mL。 5.8 旋转蒸发仪。 5.9 均质器。 6试样制备与保存 6.1试样制备 抽取河豚鱼、鳗鱼及烤鳗等样品约500g，取可食用部分，绞碎，充分混匀，分装人洁净的容器内，密 闭并做好标记。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染，且尽可能避光操作，尽量减少氧气接触机 会并尽快完成。在样品提取时严格控制操作温度，最高不超过35℃，以防止角黄素含量发生变化 6.2试样保存 试样于一18℃以下冷冻保存。 7测定步骤 SAG 7.1提取 称取5g试样（精确至0.01g）于50mL聚丙烯离心管中，加人10g无水硫酸钠.0.1g焦性没食子 酸，加乙睛2×20mL，均质提取1min。以3000r/min离心3min。合并提取液于另一个50mL聚内 烯离心管中。待净化。 7.2净化 在乙睛提取液中加人20mL乙睛饱和的正已烷（4.3），涡旋混匀后振荡3min，以2000r/min离心 2min，弃去上层正已烷，取下层乙腈20mL，旋转蒸发近干，用5mL乙睛定容，过0.2μm滤膜，待 测定。 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 a) 色谱柱：BEHCis，1.7μm，50mmX2.1mm（内径）或相当者； b) 流动相：乙腈十0.1%甲酸溶液（97+3）； c) 流速：0.30mL/min； 柱温：30℃； d) e) 进样量：5.0μL； f）检测波长：470nm。 7.3.2色谱测定 根据试样中被测物质的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待 测样液中角黄素的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上述色谱 2 GB/T22958—2008 条件下，角黄素反、顺式异构体的保留时间分别为1.10min和1.26min。根据标准溶液色谱峰的保留 时间和峰面积，对样液的色谱峰进行定性并用外标法定量。角黄素标准溶液的液相色谱图参见附录A 中的图A.1。角黄素标准物质的多反应监测（MRM)色谱图参见附录B中的图B.1。角黄素添加浓度 及其平均回收率的试验数据参见附录C中的表C.1。 7.4确证 7.4.1液相色谱参考条件 a) 色谱柱：BEHCis，1.7μm，50mmX2.1mm(内径)或相当者； 流动相：乙腈（4.2）+十0.1%甲酸（4.8）（97+3）； c) 流速：0.40mL/min； d) 柱温：35℃； 进样量：5.0μL e) 7. 4. 2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾源ESI,正离子模式（ESI十）； 扫描方式：多反应监测（MRM）； c) 毛细管电压：3.5kV； d) 锥孔电压：38V； e) 离子源温度：120℃； f) 去溶剂气温度：400℃； g) 去溶剂气（氮气）流量：800L/h； h) 锥孔气（氮气）流量（N2）：50L/h； i) 碰撞能量：20V； j) 碰撞气流量：0.1L/h； k) 检测离子对：定量：565.5/203.1；定性：565.5/203.1,565.5/133.1。 7.4.3液相色谱-串联质谱确证 将各被测组分分别选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保 留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差土2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接 近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表1规定的范围，则可判定样品中 存在对应的待测物。 表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 相对离子丰度K K>50 20<K< 50 10<K<20 K≤10 允许最大偏差 ±20 ±25 ± 30 ±50 7.5平行试验 按以上步骤对同一试样进行平行试验测定。 SAC 7.6空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行测定。 8结果计算 角黄素残留量的测定结果按式（1)计算。 V1 000 X=cX 1000 ·(1) m 式中： X一—试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； 3