ICS 67.050 x 04 中华人民共和国国家标准 GB/T22959—2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素 和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of chloramphenicol,thiamphenicol and florfenicol residues in fugu,eel and baked eel- LC-MS-MS method 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22959—2008 前言 本标准的附录A、附录 B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：林海丹、李宪华、谢守新、林峰、黄华军、邵琳智、庞国芳 GB/T22959—2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲霉素 和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了河豚鱼，鳗鱼和烤鳗中氯霉素（chloramphenicol）、甲砜霉素（thiamphenicol）和氟苯尼 考（florfenicol)及其代谢物氟苯尼考胺（florfenicolamine）残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的测定 本标准的方法检出限：河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素为0.1μg/kg，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考 胺为 1. 0 μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1— 2004,ISO 5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2一2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682一2008ISO3696：1987，MOD） 3原理 样品中的氯霉素、甲矾霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液旋转蒸 发挥干，残渣以水溶解，经正已烷液液分配脱脂。液相色谱-串联质谱仪检测，氯霉素、甲矾霉素和氟苯 尼考以内标法峰面积定量，氟苯尼考胺以外标法峰面积定量。 4试剂 所用试剂除注明外均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙酸乙酯。 4.3正已烷。 4.4 氨水：25%~28%。 4.5无水硫酸钠：使用前经650℃灼烧4h。 4.6标准物质：氯霉素（CAS：56-75-7）、甲砜霉素（CAS：15318-45-3）和氟苯尼考（CAS：76639-94-6），纯 度≥99.5%；氟苯尼考胺，纯度≥98.0%。 4.7内标标准液：氛代氯霉素（ds-氯霉素），100μg/mL，溶剂为乙睛，氛化度≥98%。 4.8100μg/mL标准储备液：分别准确称取适量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺标准物 质（4.6），用甲醇分别配成100μg/mL的标准储备液。该溶液于一18℃保存。 4.91ug/mL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考混合标准储备液：分别准确吸取1.00mL氯霉素、甲砜霉 1 GB/T22959—2008 氟苯尼考混合标准储备液。该溶液于一18℃保存。 4.101μg/mL氟苯尼考胺标准储备液：准确吸取1.00mL氟苯尼考胺标准储备液（4.8），移至100mL容 量瓶中，用甲醇配成1μg/mL的氟苯尼考胺标准储备液。该溶液于一18℃保存。 4.1120ng/mL氯霉素、甲霉素和氟苯尼考混合标准中间液：准确吸取1.00mL混合标准储备液 （4.9），移至50ml容量瓶中，用水配成20ng/mL的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考混合标准中间液。该 溶液于4℃保存。 4.1220ng/mL氟苯尼考胺标准中间液：准确吸取1.00mL氟苯尼考胺标准储备液（4.10），移至50ml 容量瓶中，用水配成20ng/mL的氟苯尼考胺标准中间液。该溶液于4℃保存。 4.131μg/mL内标标准储备液：准确吸取1.00μL内标标准液（4.7），移至10mL容量瓶中，用甲醇 配成1ug/mL内标标准储备液。该溶液于一18℃保存。 4.1420ng/mL内标标准中间液：准确吸取1.00mL内标标准储备液（4.13），移至50mL容量瓶中， 用水配成20ng/mL的内标标准中间液。该溶液于4℃保存。 临用时吸取一定量的混合标准中间液（4.11）和内标标准中间液（4.14），用空白基质溶液配成适当浓度 4.16氟苯尼考胺基质标准工作溶液：根据标准的灵敏度和仪器线性范围，临用时吸取一定量的标准中 间液（4.12），用空白基质溶液配成适当浓度的氟苯尼考胺基质标准工作液， 4.17滤膜：0.2μm。 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g 5.3离心机：转速≥4000r/min。 5.4小型台式离心机：转速13000r/min。 5.5 组织捣碎机。 SAC 5.6匀浆机。 5.7 减压旋转蒸发仪。 5.8 超声波水浴。 5.9旋涡振荡器。 5.10 聚丙烯离心管：带盖，50mL，1.5mL。 5.11鸡心瓶：25mL。 5.12具塞比色管：50mL。 6试样制备与保存 6.1试样的制备 从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约500g，用组织碎机充分捣碎均匀，装入洁净容 器，密封，并标明标记 制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2试样的保存 将试样于一18℃冰箱中保存。 2 GB/T22959—2008 7测定步骤 7.1提取 称取5g试样，精确至0.01g，置于50mL聚丙烯离心管中，加人内标标准中间液（4.14)75.0uL， 加人25mL乙酸乙酯，0.75mL氨水（4.4），3g无水硫酸钠，匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上 清液转移至50ml比色管中。另取一50mL离心管加入20mL乙酸乙酯，0.60mL氨水，洗涤匀浆刀 头10s，洗涤液移人第一支离心管中，用玻棒搅动残渣，旋涡振荡提取1min，超声波振荡提取5min， 4000r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管，乙酸乙酯定容至50.0mL。摇匀后移取10.0mL 乙酸乙酯提取液于25mL鸡心瓶，45℃减压旋转浓缩至干。 7.2净化 鸡心瓶中的残渣用2.00mL水溶解，旋涡振荡混匀，超声5min，加人3mL正已烷旋涡振荡混合 30s，静置分层，弃掉上层的正已烷，再加3mL正已烷旋涡振荡混合30s，静置分层，移取部分下层的水 相于1.5mL的聚丙烯离心管中，13000r/min离心5min，经0.2μm滤膜过滤后，供液相色谱-串联质 谱测定氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。另吸取100μL滤液于液相进样瓶，加人400μL水，混匀，供液相 色谱-串联质谱测定氟苯尼考胺。 7.3空白基质溶液的制备 称取5g空白样品，精确至0.01g，除不加人内标标准中间液，其他按7.1和7.2步骤操作。 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 7.4.1.1氯霉素、甲霉素和氟苯尼考测定 a) 色谱柱：SUPELCODiscoveryCis，5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； b)） 柱温：40℃； c) 流动相：甲醇-水（2十3)； d) 流速：0.30mL/min； 进样量：20μL。 7.4. 1.2 氟苯尼考胺测定 a) 色谱柱：IntersilCg-3，5μm，150mm×4.6mm（内径）或相当者； b) 柱温：40C； c) 流动相：甲醇-水（4十1）； 流速：0.30mL/min； 进样量：10μL。 7. 4. 2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）； b) 扫描方式：负离子扫描（氯霉素、甲矾霉素和氟苯尼考测定），正离子扫描（氟苯尼考胺测定）： c) 检测方式：多反应选择离子检测（MRM）； d) 电喷雾电压（IS)：一4200V（氯霉素、甲矾霉素和氟苯尼考测定），4500V（氟苯尼考胺测定）； e) 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量 以使质谱灵敏度达到检测要求； f) 辅助气温度（TEM）：600℃C； 定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表1。 3