ICS 67.050 X 04 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 22965—2008 牛奶和奶粉中12种β-兴奋剂 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of 12 β-agonists residues in milk and milk powder- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22965—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：杨方、刘正才、林永辉、余孔捷、黄杰、李耀平、陈健、庞国芳。 GB/T22965—2008 牛奶和奶粉中12种β-兴奋剂 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准适用于牛奶和奶粉中12种β-兴奋剂多残留的测定。12种β-兴奋剂药物包括溴布特罗 （brombuterol）、塞曼特罗（cimaterol）、克仑特罗（clenbuterol）、克仑潘特（clenpenterol）、羟甲基氨克仑 特罗（hydroxymethylclenbuterol）、苯氧丙酚胺（isoxsuprine）、马布特罗（mabuterol）、莱克多巴胺 （ractopamin）、利托君（ritodrine）、沙丁胺醇（salbutamol）、特布他林（terbutaline）和妥布特罗 (tulobuterol)。 本标准的的方法检出限：牛奶中莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特和克仑特罗的检出限为 0.05μg/kg,溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、利托君、苯氧丙酚胺和羟甲基氨克仑特罗的检出 限为0.25ug/kg；奶粉中莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特和克仑特罗的检出限为 0.4ug/kg溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、利托君、苯氧丙酚胺和羟甲基氨克仑特罗的检出 限为2.0 μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD） 3原理 阳离子交换反相吸附固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2异丙醇。 4.3乙酸乙酯。 4.4乙睛：色谱纯。 4.5甲酸。 4.6高氯酸。 1 GB/T22965—2008 4.7盐酸。 4.8氢氧化钠。 4.9乙酸铵：色谱纯。 4.10氨水。 4.11氯化钠。 4.1210mol/L氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠至100mL水中，混匀。 4.130.1mol/L高氯酸溶液：移取0.4mL高氯酸至100mL水中，混匀。 4.14 0.1mol/L盐酸溶液：移取0.85mL盐酸至100mL水中，混匀。 4.15 55mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g乙酸铵至约800mL水中，加入2ml甲酸，定容至 1000mL，混匀。 4.16甲醇-0.1%甲酸溶液：移取0.1mL甲酸于约50mL水中，加人10mL甲醇，以水定容100mL， 混匀。 4.17标准物质：溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、 莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，纯度大于98.0%。 4.18内标标准物质：盐酸克仑特罗-D9、盐酸莱克多巴胺-D5、沙丁胺醇-D3，纯度大于98.0%。 4.19标准储备液（100ug/mL）：准确称取适量的溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨 克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，用甲醇分别配 制成100μg/mL的标准储备液，一20℃冰箱中保存。 4.20混合标准储备液（1μg/mL）：分别准确量取1.0mL的标准储备液至100mL容量瓶中，用甲醇 稀释至刻度，一20℃冰箱中保存。 4.21内标储备液（100μg/mL）：准确称取适量的克仑特罗-D9、莱克多巴胺-D5、沙丁胺醇-D3对照品， 用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液，一20℃冰箱中保存。 4.22内标工作液（10ng/mL）：分别准确量取适量的同位素内标储备液至同一容量瓶中，用甲醇稀释 定容成浓度为10ng/mL的同位素内标工作液，一20℃下冰箱中保存。 4.23基质标准工作溶液：以空白基质溶液将混合标准储备液与内标工作液稀释至适当浓度，临用 现配。 化，保持柱体湿润。 4.25滤膜：0.2μm。 5仪器和设备 5.17 高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离（ESI)源。 5.2天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3 组织捣碎机。 5.47 高速冷冻离心机：转速可达15000r/min，制冷可达4℃。 5.5离心机：5000r/min。 5. 6 旋涡振荡器。 5.7电热恒温振荡水槽。 5.8 pH计。 5.9旋转蒸发仪。 5.10固相萃取装置。 5.11氮吹仪。 2 GB/T22965—2008 6试样制备和保存 6.1试样制备 取不少于500g有代表性的牛奶或奶粉，充分混匀，分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记 6.2试样保存 牛奶置于4℃冰柜中避光保存，奶粉则在室温下置于干燥器保存。 7测定步骤 7.1提取 7.1.1牛奶 准确称取10g（精确到0.01g）牛奶样品于50mL聚丙烯离心管内，加人50μL10ng/mL的内标 物，加入20mL0.1mol/L盐酸溶液（4.14），涡旋混匀，于37C下避光水浴振荡16h（过夜），取出冷却 至室温，涡旋混匀，4℃下15000r/min离心10min，分取10mL上清液转移至另一50mL离心管内。 加人5mL0.1mol/L高氯酸溶液（4.13），用10mol/L氢氧化钠溶液（4.12）调节pH值至9.7土0.3,加 人约2g氯化钠，再加人25mL异丙醇-乙酸乙酯（3+2），涡动提取2min，4500r/min离心5min，取出 4500r/min离心5min，合并有机相，40℃下旋转蒸发至近干，加人5mL0.1mol/L盐酸溶液（4.14）， 涡动1min，待净化。 7.1.2奶粉 取12.5g奶粉于烧杯中，加适量35℃～50℃水将其溶解，待冷却至室温后，加水至总质量为 100g，充分混匀后准确称取10g（精确到0.01g）样品于50mL聚丙烯离心管中，按7.1.1步骤进行 处理。 7.2净化 将7.1所得溶液以约1mL/min的流速全部过混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱（4.24），依 次用3mL水、3mL2%甲酸水溶液和2mL甲醇淋洗，抽干，用5mL5%氨水甲醇溶液（体积分数）洗 脱，洗脱液于40℃下以氮气吹至近干，以0.5mL甲醇-0.1%甲酸溶液（1十9）溶解，涡动混匀，过 0.2um滤膜（4.25），供液相色谱-串联质谱仪测定 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品10g（精确至0.01g），按7.1和7.2步骤操作。 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 a) 色谱柱：AcquityUPLCBEHCis，1.7μm，2.1mm×55mm（内径）或相当者； b) 流动相：A为5mmol/L乙酸铵溶液（4.15），B为0.1%甲酸乙（体积分数），梯度洗脱，洗脱 程序见表1； 表1 # 梯度洗脱程序 时间/min A/% B/ % 0. 00 85 15 1.0 85 15 2.0 30 70 2.5 30 70 3.0 85 15 5.0 85 15 3