ICS 67.050 X 04 中华人民共和国国家标准 GB/T22964—2008 河豚鱼、鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、 红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、 吉他霉素、交沙霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of lincomycin, oleandomycin, erythromycin, tilmicosin tylosin, spiramycin, kitasamycin and josamycin residues in fugu and eel- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22964—2008 前言 本标准的附录A、附录 B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人：王飞、王海洋、曹彦忠、贾光群、张进杰、石玉秋、庞国芳 22 GB/T22964—2008 河豚鱼、鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素 红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素 吉他霉素、交沙霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉 素和交沙霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉 素和交沙霉素残留量的测定。 本标准的方法检出限：河豚鱼中的林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉 他霉素和交沙霉素均为2.0μg/kg。鳗鱼中的林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素均为2.0μug/kg， 螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星均为5.0 μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2：1994，IDT) 3原理 河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素 色谱-串联质谱法测定，内标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。 4.1水:GB/T6682，一级。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙酸铵。 4.4乙腈：色谱纯。 4.5盐酸。 4. 6 三羟甲基氨基甲烷（tris):C,HiNO。 1）OasisHLB固相萃取柱是waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示 对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 1 GB/T22964—2008 4.7氯化钙：CaCl2·2H0。 4.8甲醇溶液：2+3。400mL甲醇（4.2）与600mL水混合。 4.90.01mol/L乙酸铵溶液：0.77g乙酸铵（4.3溶解于水中，定容于1000mL容量瓶中。 4.10定容液：0.01mo1/L乙酸铵溶液（4.9）十乙腈（4.4）（17十3）。 4.11tris溶液：称取12.0g三羟甲基氨基甲烷（4.6）、7.35g氯化钙（4.7)溶解于1000mL水中，用盐 酸（4.5）调节pH值为9。 4.12标准物质：林可霉素（CAS：7179-49-9）、竹桃霉素（CAS：7060-74-4）、红霉素（CAS：59319-72-1）、 替米考星（CAS：108050-54-0）、泰乐菌素（CAS：74610-55-2）、螺旋霉素（CAS：8025-81-8）、吉他霉素 （CAS：1392-21-8）、交沙霉素（CAS：16846-24-5）和内标物质罗红霉素（CAS：80214-83-1），纯度≥95%。 4.13标准储备溶液I：1.0mg/mL。依次准确称取每种标准物质（4.12）适量，分别放人相应的10mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀。4℃保存。 4.14标准储备溶液Ⅱ：10.0μg/mL。依次吸取0.1mL各标准储备溶液I（4.13），分别放人相应的 10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。4℃保存。 4.15标准工作溶液：2.0μg/mL。依次吸取2.0mL混合标准储备溶液Ⅱ（4.14），分别放人相应的 10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。 4.16内标储备溶液：1.0mg/mL。准确称取10.0mg罗红霉素（4.12）于10mL容量瓶中，用甲醇溶 解定容至刻度，混匀。4℃保存。 4.17中间浓度内标溶液：10.0μg/mL。吸取0.1mL内标储备溶液（4.16）于10mL容量瓶中，用甲 醇定容至刻度。4℃保存。 4.18内标工作溶液：1.0μg/mL。吸取1.0mL中间浓度内标标准溶液（4.17)于10mL容量瓶中，用 甲醇定容至刻度。 4.19基质标准混合工作溶液： 测定河豚鱼用基质标准混合工作溶液：分别吸取1.0uL、2.0uL、5.0uL、25.0L标准工作溶液 （4.15），依次加人相应的试剂瓶中，再分别加人20.0μL内标工作溶液（4.18），用样品空白提取液定容 至1.0mL。配成林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素分 别为2.0ng/mL4.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL的四个浓度水平的系列基质标准混合工作 溶液。 测定鳗鱼用基质标准混合工作溶液：分别吸取林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素各1.0μL、 2.0L、5.0μL、25.0μL标准工作溶液（4.15）和螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星各2.5μL、 5.0μL、10.0μL、25.0μL标准工作溶液（4.15），依次加入相应的试剂瓶中，再分别加入20.0μL内标 工作溶液（4.18），用样品空白提取液定容至1.0mL。配成林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素分别 为2.0ng/mL、4.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL和螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星分别 为5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL的四个浓度水平的系列基质标准混合工作 溶液。 4.20OasisHLB固相萃取柱：500mg，6mL，或相当者。使用前，先后用10mL甲醇和10mL水活 化，在抽真空前的各步骤中，都保持柱体湿润。 4.21滤膜：0.2μm。 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2天平：感量0.01g,0.0001g。 5.3固相萃取装置。 5.4 氮气浓缩仪。 5.5具塞聚丙烯离心管：50mL。 2 GB/T 22964—2008 5.6离心机：20000g离心力（或相当于12000r/min）。 5.7超声波清洗仪。 5.8 pH计。 5.9振荡器。 6试样制备与保存 6.1试样的制备 从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装洁净容器内。密 封后作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的 变化。 6.2试样的保存 将试样于一18℃保存。 7测定步骤 7.1提取 称取5g试样，精确至0.01g，置于50mL离心管（5.5）中，加人20.0L内标工作溶液（4.18）和 小于1.0mL/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱（4.20）。再加人10.0mLtris溶液（4.11），于振 荡器上剧烈振荡10min。以12000r/min转速离心10min，取上清液以小于1mL/min的流速通过 OasisHLB固相萃取柱。 7.2净化 待样液全部流出后，先后用10mL水和10mL甲醇溶液（4.8）洗柱，弃去全部流出液，将固相萃取 柱用真空泵抽干1h。再用10mL甲醇（4.2)洗脱于15mL氮吹管中，用氮气浓缩仪于50℃水浴中吹 至近干，准确加人1.0mL定容液（4.10），于超声波仪中超声波助溶残渣。用阴性样品，按上述步骤制 备空白样品提取液。过0.2μm滤膜（4.21)后，供液相色谱-串联质谱仪测定。 按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液 7.3测定条件 7.3. 1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱：AtlantisCi，内径3um，150mm×2.1mm（内径）或相当者； b) 流动相A：乙睛； c) 流动相B：0.1%甲酸水溶液； d) 流动相C:甲醇； e) 梯度洗脱条件：见表1； 流速：0.2mL/min； 柱温：30℃； g) h) 进样量：20μL。 表1梯度洗脱条件 时间/min A/% B/% C/% 0. 00 90.0 5. 0 5. 0 5.00 5.0 90.0 5.0 9.00 5.0 90.0 5.0 9.10 90.0 5. 0 5.0 17. 0 90.0 5.0 5.0 3