ICS 67.050 X 04 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T 22992—2008 牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、 已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of zearalanol,zearalanone,diethylstilbestrol,hexestrol and dienoestrol multi-residues in milk and milk powder- LC-MS-MS method 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22992—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 疫局。 本标准主要起草人：许泓、吴延晖、何佳、张骏、张曼、林安清、庞国芳 GB/T22992—2008 牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、 已烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛奶和奶粉中玉米赤霉醇（zearalanol）、玉米赤霉酮（zearalanone）、已烯雌酚（dieth- ylstilbestrol）、已烷雌酚（hexestrol）、双烯雌酚（dieno-estrol)残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准用于牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定。 本标准方法检出限：牛奶中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚为1.0μg/L； 奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚为8.0μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT) 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2:1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 用乙睛作为蛋白沉淀剂和提取剂进行提取，阴离子固相萃取柱进行净化，用液相色谱-串联质谱仪 测定，内标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。 4.1水:GB/T6682，一级。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙腈：色谱纯。 4.4氨水。 4.5甲酸。 4.6 氢氧化钠。 4.7 5mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠，用蒸馏水定容到1L。 4.8淋洗液：氨水-水（1+19）。 4.9洗脱液：甲酸-甲醇（1+19）。 4.10激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇（包括α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%）纯度大于等 于97%；玉米赤霉酮，纯度大于等于97%；已烯雌酚，纯度大于等于99%；己烷雌酚，纯度大于等于 1 GB/T22992—2008 98%；双烯雌酚，纯度大于等于98%。 4.11标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、双烯雌酚和已烷雌酚标准物 质，用甲醇（4.2）配制成1mg/mL标准备溶液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液 作为标准工作溶液，保存于4℃冰箱中。 4.12内标标准物质：α-玉米赤霉烯醇-4氛代，纯度大于等于99%；已烯雌酚-8氛代，纯度大于等 于98%。 4.13内标标准溶液：准确称取适量玉米赤霉烯醇-4氛代和已烯雌酚-8氛代标准物质，用甲醇（4.2)分 别配制成1mg/mL标准贮备溶液。再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标工作溶液，保存于4℃冰 箱中。 7.1.1及7.1.2处理后得到的溶液。 4.15基质标准工作溶液：将标准工作溶液（4.11)及内标工作溶液（4.13)混合后在氮吹仪中吹干，以基 质提取液（4.14）溶解，涡旋30s后即为基质标准工作溶液。 4.16OasisMAX阴离子固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。 4.17滤膜：0.2μm。 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾电离源。 5.2自动固相萃取仪或固相萃取装置。 5.3氮气吹干仪。 5.4涡旋振荡器。 5.5离心机：转速大于3500r/min。 5.6高速离心机：转速大于9000r/min，温度可控制在4℃。 6试样的制备 6.1牛奶 取50mL新鲜或解冻的牛奶混合均匀，3500r/min离心5min，取下层。 6.2奶粉 取12.5g奶粉于烧杯中，加适量35℃~50℃水将其慢慢溶解，转移至100mL容量瓶中，待冷却 至室温，用水定容混匀。取50mL，以3500r/min离心5min，取下层。 7测定步骤 7.1混合基质标准校准溶液的制备 7.1.1样品量取 于50mL离心管中，分别加人不同量混合标准工作溶液（4.11），使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤 霉酮、已烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚的浓度为2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、 50ng/mL。再分别加人适量内标标准工作溶液（4.13），使其浓度均为10ng/mL，在氮吹仪上于40℃水 浴中吹干。取5个阴性样品，每个样品为5mL，置于上述离心管中涡旋混合后，加10mL乙睛，涡旋混 合3min，3500r/min离心10min，取上清液于离心管中，再向样品中加入5mL乙睛，同前操作，合并 1）OasisMAX阴离子固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并 不是表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T22992—2008 9000r/min离心5min，备用。 7.1.2提取净化 固相萃取净化条件：先用2mL甲醇、2mL水将柱子活化，流速均为4mL/min。将7.1.1样品上 清液上柱，流速为1mL/min，依次用1mL淋洗液（4.8）、0.5mL甲醇以3mL/min的速度淋洗，通人 20mL空气以4mL/min的速度吹过OasisMAX柱。用4mL洗脱液（4.9）洗脱，流速为1mL/min， 加人30mL空气以6mL/min的速度吹过OasisMAX柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮吹仪上于40℃ 水浴中吹干，加人1mL流动相，涡旋30s溶解。溶液过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。 7.2实测样品溶液的制备 取待测样品5mL于50mL离心管中，加人适量内标标准工作溶液（4.13），使其最终定容浓度均为 10 ng/mL。按7.1.1及7.1.2操作。 7.3空白基质溶液的制备 取阴性样品5mL于50mL离心管中，按7.1.1及7.1.2操作。 7.4测定条件 7.4.1液相色谱条件 液相色谱条件如下： 色谱柱：ZORBAXEclipseSB-Cs，3.5μm，150mmX4.6mm(内径）或相当者； a) b) 柱温：25℃； c) 流动相：乙睛-水（7+3）； d) 流速：0.5mL/min； e) 进样量：50μL。 7. 4. 2 质谱条件 质谱条件如下： a) 离子化方式：电喷雾电离； b) 扫描方式：负离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（MRM)； d) 离子源温度：350℃； e) 雾化气压力：0.083MPa； f) 气帘气压力：0.1240MPa； g) 辅助气1压力：0.2756MPa； h) 辅助气2压力：0.2412MPa； i) 喷雾器电流：-5μA； j) 电喷雾电压：4500V； k) 定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压见表1。 表15种激素及代谢物的定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压 化合物名称 定性离子对（m/） 定量离子对(m/） 碰撞能量/V 去簇电压/V 42 -110 320.6/277.2 玉米赤霉醇 321.1/277.2 321.1/161.0 40 100 -40 110 318.7/160.8 玉米赤霉酮 318.7/160.8 318.7/107.0 45 110 50 -90 玉米赤霉烯 322.9/159.9 322.9/159.9 醇-4氛代 322.9/130.1 43 -90 3