ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T28062—2011 柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法 Detection of Candidatus Liberibacter asiaticus using the real-time fluorescent PCR 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 28062—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：重庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：般幼平、王中康、王玉玺、高文娜、夏玉先、曹月青、彭国雄、李正国。 I GB/T28062—2011 柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌（CandidatusLiberibacterasiaticus）实时荧光PCR检测的 样品制备、检测操作方法及结果判定标准。 测和病害鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB5040柑桔苗木产地检疫规程 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 柑桔黄龙病CitrusHuanglongbing 种由韧皮杆菌引起的植物检疫性病害。主要侵染柑桔属、金柑属和积属等柑桔类植株重。由带 菌种苗远距离传播，田间主要由柑桔木虱取食传播。典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化，枝梢黄化，果 实畸形，种子败育，严重时可引起植株死亡。 3. 2 实时荧光PCR real-timefluorescentPCR 实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光 物质的释放或荧光物质与扩增产物结合并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。 3.3 扩增引物 primer 人工合成的寡核苷酸序列,其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外 扩增。 3. 4 扩增模板 templet DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。 3.5 Ct值cyclethresholdvalue 实时荧光PCR反应中每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数 3.6 亚洲韧皮杆菌重组质粒DNA recombinantplasmidDNA 利用特异性引物扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌基因组模板，获得的亚洲韧皮杆菌特异性DNA扩 1 GB/T28062—2011 增序列，经构建重组质粒、转入大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后，重新提取获得的质粒DNA。用于 作为柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光PCR检测的阳性对照。 4柑桔黄龙病菌基本信息 学名：亚洲韧皮杆菌CandidatusLiberibacterasiaticus。 病害名称：柑桔黄龙病，常用英文名：CitrusHuanglongbing。 分类地位：α-细菌亚纲、根瘤细菌目（Rhizobiales），根瘤细菌科（Rhizobiaceae），韧皮杆菌属 Liberibacter的G细菌。是一种难培养细菌。 引起柑桔黄龙病的韧皮杆菌根据其核糖体基因序列的差异可以分为3种，即分布于非洲的柑桔黄 龙病非洲韧皮杆菌CandidatusLiberibacterafricanus，分布于南美洲的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌Can- didatusLiberibacteramericanus和分布于亚洲及北美的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌CandidatusLiberi- bacter asiaticus Jagoueix et al。 柑桔黄龙病菌其他信息参见附录A。 本标准规定了对亚洲韧皮杆菌的检疫鉴定方法。对来自于非洲的柑桔材料的检疫检验，可参见附 录B检测柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌；对来自美洲的柑桔材料，除利用本标准检测柑桔黄龙病亚洲韧皮 杆菌外，可参见附录C检测柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌。 5方法原理 本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是，利用 病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结 合而发出荧光被检测器实时检测（荧光染料法），或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双 标记探针，探针5端和3端分别标记荧光素报告基团和萍灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA 模板，引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，Taq 时检测（荧光探针法）。由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历 的Ct值不同，因此Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量。 6实验室设置 参照GB/T19495.2。实验室应至少分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应试剂配制区 和检测区；每个工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。 7主要仪器设备和试剂 7.1仪器设备 7.1.1实时荧光PCR仪。 7.1.2高速台式离心机。 7.1.3生物安全柜或超净工作台。 7.1.4冰箱（冷藏室4℃和冷冻室一20℃）。 7.1.5涡旋混匀仪。 7.1.6紫外灭菌灯。 2 GB/T 28062—2011 7. 1. 7 微量可调移液器（0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL）。 7. 1. 8 带滤芯Tip头。 7.1.9PCR反应管(0.2mL八联管）。 7. 1. 10 微滤柱。 7. 1. 11 高压灭菌锅。 7. 2 试剂 7.2. 1 次氯酸钠（NaCIO：）。 7.2. 2 十二烷基硫酸钠（SDS)。 7.2. 3 蛋白酶K（ProteinaseK)。 7.2.4 三羟甲基氨基甲烷(Tris)。 7.2.5 乙二胺四乙酸（EDTA）。 7.2. 6 盐酸胍（Guanidinge HCl）。 无水乙醇（ethanol)。 7. 2. 7 7.2. 8 实时荧光PCR混合试剂(Real-timePCRMasterMix）。 8 取样及样品处理 8.1 取样用具 8.1.1样品袋：牛皮纸袋或信封（一次性使用）。 8.1.2枝剪。 8.1.3剪刀，镊子，打孔器。 8.1.4研钵。 8. 1.5 塑料离心管（1.5mL）。 8.1.2～8.1.5的取（制）样用工具应经121℃士2℃，15min高压蒸汽灭菌。田间采样每个样品采 集后或实验室处理每个不同样品后，工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上，以避免样品间相互污染。 8.2 取样方法 8.2.1实地取样 SZAIC 产地检疫田间实地取样参照GB5040。 8.2. 2 叶片样品 疑似病树按树冠东南西北四方采集，每点取中下部成熟叶片各5片，每棵树共采集叶片20张 种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株（无症材料）10株，每株取中下部成熟叶片5片，共 50片。 接穗等繁殖材料按规程规定的比例抽取样品。 黄龙病病害症状及疑似症状详参见附录D。 8.2.3果实样品 幼果期采样，切取果柄和果蒂，每样品采集4份；商品鲜果每批果实随机抽取10个果实，切取果柄 和果蒂。 3