ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28068—2011 柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法 Detection of Xanthomonas citri subsp.citri using the real-time fluorescent PCR 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28068—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：重庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：王中康、殷幼平、王福祥、高文娜、夏玉先、李正国、曹月青 GB/T28068—2011 柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了柑桔溃疡病菌（Xanthomonascitrisubsp.citri，Xcc)的实时荧光PCR检测的样品制 备、检测技术、操作方法及结果判定标准。 本标准适用于柑桔植物材料中柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB5040柑桔苗木产地检疫规程 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件， 3. 1 柑桔溃疡病 citruscankerdisease 由柑桔溃疡病菌引起的国内外柑桔检疫性细菌病害。症状特征表现为柑桔叶片、枝条和果实表面 出现隆起的木栓化溃疡病斑，造成柑桔落叶落果、树势衰弱，严重影响柑桔产量与果品外观质量。 3.2 柑桔溃疡病菌 Xanthomonas citri subsp.citri Young 2008)。 3.3 实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR 实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光 物质的释放并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。 3. 4 扩增引物 primer 人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外 扩增。 3.5 扩增模板templet DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。 3.6 Ct 值 cyclethresholdvalue 实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 1 GB/T28068—2011 3.7 柑桔溃疡病菌重组质粒 利用特异性引物扩增柑桔溃疡病菌（Xanthomonascitrisubsp.citri）基因组模板，获得的柑桔溃疡 菌特异性DNA扩增序列构建重组质粒，将该重组质粒转导到大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后，重 新提取出获得的质粒DNA。用于作为柑桔溃疡病菌检测的阳性对照。 4柑桔溃疡病菌基本信息 拉丁学名：柑桔黄单胞菌柑桔亚种Xanthomonascitrisubsp.citriGabrielet.al（1989）。 病害名称：柑桔溃疡病citruscancerdisease。 分类地位：假单胞菌科Pseudomonaceae、黄单胞菌属Xanthomonas，柑桔黄单胞Xanthomonas citri [Gabriel et.al (1989)]。 葡萄柚、甜橙、柠檬、莱檬、柑桔和积等柑桔种和品种。带菌种苗、接穗及商品果实是远距离传播的主要 途径田间则主要由夹风雨和农事操作传播。 柑桔溃疡病菌其他信息参见附录A。 利用柑桔溃疡病菌亚种通用引物对XccF05/XccR05以常规PCR方法可以检测出柑桔材料中柑 桔黄单胞柑桔亚种（A菌系）和褐色黄单胞莱檬亚种（BC/D菌系）（检测引物、检测方法及结果判定参见 附录 B)。 5方法原理 本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是，利用 病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结 合而发出荧光被检测器实时检测（荧光染料法），或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双 标记探针，探针5'端和3端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA DNA聚合酶将探针水解成单核苷酸，使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实 时检测（荧光探针法）。由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测值时所经历 的Ct值不同，因此Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量。 6实验室设置 柑桔溃疡病菌PCR检测实验室主要参照GB/T19495.2设置与管理。检测实验室应至少分为三 个相对独立的工作区域：样本制备区、反应试剂配制区和检测区；每个工作区域应有明确标记，避免不同 工作区域内的设备、物品混用。 7材料与试剂 7.1仪器与器材 7.1.1实时荧光PCR仪。 7.1.2高速台式离心机。 7.1.3生物安全柜或超净工作台。 2 GB/T28068—2011 7.1.4冰箱（冷藏室4℃和冷冻室一20℃）。 、涡旋混匀仪。 7. 1. 5 7. 1. 6 紫外灭菌灯。 7. 1. 7 微量可调移液器（0.5μL~10μL、10μL～100μL、100μL~1000μL）。 7. 1. 8 ，带滤芯Tip头。 7. 1. 9 ：PCR反应管（0.2mL八联管）。 7. 1. 10 微滤柱。 7. 1. 11 高压灭菌锅。 7.2试剂 7.2.1 磷酸二氢钠（NaH,PO,·H,O)。 7. 2. 2 磷酸氢二钠(Naz2HPO,·7H,O)。 7.2. 3 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 7.2. 4 乙二胺四乙酸（EDTA）。 7.2. 5 实时荧光PCR混合试剂(Real-timePCRMasterMix）。 8 采样及样品处理 8.1 采样及样品处理工具 8.1.1样品袋：牛皮纸袋或信封（一次性使用）。 8.1.2枝剪。 8. 1.3 剪刀，镊子。 8.1.4塑料离心管(1.5mL,50mL)。 8.12~8.1.4的取（制）样工具应经121℃土2℃，15min高压蒸汽灭菌。田间取样每个样品采集 后或实验室处理每个不同样品后，工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上，以避免样品间相互污染 8.2取样方法 8.2.1田间采集 田间实地取样参照GB5040。 取带有柑桔疑似溃疡病病斑的柑桔叶片、嫩梢和果实样品（柑桔溃疡病症状特征参见附录A）。 8.2.2口岸检疫及调运检疫抽样 种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株（无症材料）10株，每株取叶片5片，共50片：接穗等 材料则随机直接抽取10份材料；商品果采集带有疑似病斑的果实。 样品采集后立即装人样品袋。按规定编号密封后，做好相关记载，包括样品品种、目测症状、采样 人、采集地、采集时间等。及时寄送检测实验室。 8.3样品存放 采集的植物材料若需短暂保存，应置于4℃条件下，可保存1周。检测后余下的植物材料应置于 4℃条件下保存7d，以备复测的需要。 8.4样品DNA制备操作 样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行。所制备的DNA样本在4℃条件下保存应不超过 3