ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34746—2017 犬细小病毒基因分型方法 Genotyping method of canine parvovirus 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34746—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：扬州大学、江苏农牧科技职业学院、中国动物卫生与流行病学中心、中华人民共和 国深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人：刘文博、张小荣、王海燕、徐向明、邵卫星、王涛、刘静、詹爱军。 1 GB/T 34746—2017 犬细小病毒基因分型方法 1范围 本标准规定了犬细小病毒（canineparvovirus，CPV）基因分型方法要求 本标准适用于犬细小病毒的病原分型、犬细小病毒感染疫情监测和流行病学调查 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPV：犬细小病毒（canineparvovirus） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsalinebuffer） EDTA乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid) Taq酶：Tag脱氧核糖核酸聚合酶（TagDNApolymerase） Tris：三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸混合物（deoxyribonucleotidetriphosphatesmixture） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate) dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） RNase：核糖核酸酶（ribonuclease) 4仪器 4.11 PCR扩增仪 4.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。 4.3 组织研磨器或者研钵。 4.5核酸电泳仪和水平电泳装置 4.6 微量移液器量程分别0.2±L～2μL、1μ～10uL10μL～100μ20μL～200u和100±L~ 1000uL的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。 1 GB/T34746—2017 4.7 7高压灭菌锅。 4.8凝胶成像系统（或紫外透射仪）。 5耗材 5.11.5mL无DNA酶离心管。 5.2 20.2mLPCR管。 6试剂 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 6.1水，GB/T6682三级水。 6.2氯仿：常温保存。 6.3异丙醇：使用前预冷至一20℃。 6.4无水乙醇：一20℃预冷 6.5 575%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，一20℃预冷。 6.6 5Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：一20℃保存，避免反复冻融 dNTPs：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，一20℃保存，避免反复冻融。 6.8 3DNA分子量标准：200bpDNA分子量标准。 6.9 磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见A.1。 6.10电泳缓冲液（TBE)：配方及配制方法见A.2。 6.11电泳上样缓冲液：配方及配制见A.3。 6.121%琼脂糖凝胶板：配制见A.4。 6.13c引物：Pab-s和Pab-as用于第一轮扩增，Pb-s和Pb-as用于第二轮扩增，其中s表示正义链，as代 表反义链（见附录B）。引物在使用时用灭菌双蒸水稀释为50pmol/L（见附录B）。 6.14阳性对照模板为经测序验证过犬细小病毒的基因组或VP2阳性质粒（参见C.1），阴性对照见（参 见C.2）或使用空白对照（参见C.3）。 7样品的采集和前处理 7.1工具 棉拭子、一次性无菌注射器、剪刀、镊子、研钵、1.5mL离心管、移液器吸头、药匙。所有上述取样工 具（一次性无菌注射器除外）应经121℃，15min高压灭菌并烘干；1.5mL离心管、吸头应无DNA酶 污染。 7.2采样方法 7.2.1采样过程中样本避免交叉污染，采样及样品前处理过程中戴一次性手套、口罩、帽子。 7.2.2拭子样品鼻拭子采样，采样时要将灭菌处理过的拭子深人鼻腔来回刮3次～5次，取鼻腔分泌 液。取肛门拭子，将灭菌处理过的拭子深人肛门转一圈蘸取粪便。粪便采样，用高压过的药匙取新鲜的 粪便，往往为稀便或血便 7.2.3组织样品组织样品采集时应采取有明显病变组织，编号备用。 2 GB/T34746—2017 7.3存放与运送 采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，放置一70℃冰箱，但应 避免反复冻融。采集的样品密封后，采用样品箱加冰密封，尽快运送到实验室。 7.4样品处理 7.4.1组织样品的处理 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品0.5g左右于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加 1.0mLPBS混勾，然后将组织悬液转人无菌1.5mL离心管中，4℃5000r/min离心10min，取上清 转人新的无菌1.5mL离心管中，取500μL上清，编号备用。 7.4.2粪便样品的处理 将鼻拭子和肛门拭子一起放人盛有1.0mL子悬液的1.5mL离心管中，然后将拭子悬液转入无 菌1.5mL离心管中，4℃5000r/min离心10min，取上清转人新的无菌1.5mL离心管管中，取500μL上 清，编号备用。 8DNA的提取方法 SZIC 酸钠溶液，混匀。55℃孵育30min。 8.2在样品中加入600μL酚-氯仿（体积比1：1），上下颠倒混匀，4℃12000r/min离心10min 8.3取500uL上述样品加入等体积的酚-氯仿（体积比1：1），上下颠倒混匀，4℃12000r/min离心 10 min。 8.4转移上清液到另一个1.5mL离心管中，加人800μL无水乙醇，一20℃静置10min 8.54℃，12000r/min离心10min，弃去所有液相。 8.6用1mL70%乙醇漂洗，4℃12000r/min离心5min。 8.7 真空或室温干燥，DNA沉淀物用25μL无菌双蒸水溶解作为模板，标记，保存在一20℃备用。 9 PCR扩增反应 9.1 引物及使用条件 使用两对引物对样品进行基因分型。首先使用引物对Pab-s和Pab-as对样品扩增，如果结果为阳 性，再使用引物对Pb-s和Pb-as对样品进行扩增，如扩增结果为阳性，将扩增产物测序后比对。 9.2 第一次 PCR 9.2.1反应体系 反应体系（50μL体系） 10XPCR缓冲液 5 μL 氯化镁溶液 3 μL dNTPs 3 μL 引物 Pab-s 1 μL 引物Pab-as 1 μL 3