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ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T38506—2020 动物细胞培养过程中生化参数的测定方法 Determination of biochemical parameters in animal cell culture process 2020-03-06实施 2020-03-06发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38506—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位:中国测试技术研究院生物研究所、信达生物制药(苏州)有限公司、华派生物工程 集团有限公司、上海市计量测试技术研究院、上海张江生物技术有限公司、四川大学、成都柏奥特克生物 科技股份有限公司、上海迈泰君奥生物技术有限公司、泰州迈博太科药业有限公司、上海百迈博制药有 限公司。 本标准主要起草人:周李华、周凯松、宋航、邱文英、李剑凤、刘刚、黄林、马丽侠、李振华、杨坤、李妍、 蒋子敬、方鹏飞、崔利凯、郝伟伟、叶德萍、梁智杰、张大鹏、张丽燕、郭怀祖、徐进、郭清城、戴建新, 1 GB/T385062020 动物细胞培养过程中生化参数的测定方法 1范围 本标准规定了动物细胞规模培养过程中细胞密度、细胞活率、PH值、溶解氧、渗透压、葡萄糖含量、 细菌内毒素、乳酸含量的测定方法。 本标准适用于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠骨髓瘤细胞(NSO、SP2/O)、非洲绿猴肾细胞 (Vero)、乳仓鼠肾细胞(BHK-21)、犬肾表皮细胞(MDCK)、猪睾丸细胞(ST)规模培养过程中生化参数 的检测,其他真核细胞规模培养过程中生化参数的检测也可参考使用。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 WS/T350血清葡萄糖测定参考方法 中华人民共和国药典(2015年版)二部(国家药典委员会) 中华人民共和国药典(2015年版)三部(国家药典委员会) 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 celldensity 细胞密度 细胞通过培养后,单位体积样品中细胞的总数。 3.1.2 细胞活率cell viability 细胞培养过程中,活细胞数目占总细胞数目的百分比。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ATP:腺苷三磷酸(Adenosinetriphosphate) NADH:还原型辅酶I(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,还原态)(Nicotinamideadeninedinucleotide) NAD(P):烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate) NAD(P)H:还原型辅酶IⅡI(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,还原态)(Nicotinamideadenine dinucleotide phosphate) OPC:开放平台通信(OpenPlatformCommunications) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline) 1 GB/T385062020 4一般要求 4.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯或药用级的试剂及符合《中华人民共和国药典》 (2015年版)二部中规定的纯化水或注射用水。 4.2试验使用的试剂质量应避免过期造成的试剂性能改变。因此测定前应根据试剂说明书或产品质 检报告验证试剂质量。 注:荧光染料、缓冲液等试剂不宜长时间保存。台盼蓝会由于错配导致死细胞测量结果过高或过低 4.3为减少或避免取样可能导致的污染风险,细胞培养过程中各参数测定宜采用在线检测。 4.4在线检测时,相关设备应根据生产厂商的安装确认方案、操作确认方案进行确认,并将其形成文 件。在测定前,生产厂商和/或使用者应进行设备性能确认。 4.5在线检测时电极直接插人细胞发酵液中检测,无需取样。离线检测时,应按照无菌操作要求进行 取样,取样后按照检测参数和检测方法要求,进行离心、稀释等样品处理后立即检测,不能立即检测的样 品应放置于2℃~8℃并在不超过6h内检测 5 细胞密度的测定 5.1 悬浮细胞密度的测定 SZC 5.1.1血球计数法 5.1.1.1原理 将待测样品悬浮液置于血球计数板上,于显微镜下直接计数,进而推算出细胞数目。 5.1.1.2 试剂和材料 PBS缓冲液:可自行配制亦可购买商业化产品。 5.1.1.3 仪器设备及器具 5.1.1.3.1 血球计数板:16格×25格或25格×16格 5.1.1.3.2 倒置显微镜:放大倍数×400。 5.1.1.3.3微量移液器:20μL~200μL、100μL~1000μL。 5.1.1.4测定步骤 取900μLPBS缓冲液至离心管中,加入细胞悬液100μL,依次进行10倍系列稀释,取适宜稀释度 进行计数,使得细胞数量每大方格为100个~300个。将盖玻片盖于计数板中心上方,上下吹打,轻轻 混勾,用微量移液器将细胞悬液沿盖玻片边缘缓缓加人,不留气泡,不外溢,静置2min~3min。在显 微镜下对大方格的细胞进行计数,重复计数三次,取平均数。 注:实际检测过程中,可根据预计细胞密度调整所需PBS缓冲液和细胞悬液用量 5.1.1.5 结果计算 16格×25格的血球计数板按式(1)计算,25格×16格的血球计数板按式(2)计算。 :(1) 100 2 GB/T38506—2020 .(2) 80 式中: N一一每毫升悬浮液中细胞数,单位为个; A——计数板观察细胞数,单位为个; d —细胞溶液的总稀释倍数。 计算结果表示为整数。 5.1.2自动图像分析法 5.1.2.1原理 将采集的源图像数据进行平滑处理,通过直方图阈值处理,再经过腐蚀去填充孔洞,图像灰度化、对 比度增强、边缘检测、二值化变换以及数学形态学和修正一系列图像处理计数和分析,得出细胞的确切 数量。 5.1.2.2试剂 台盼蓝溶液(0.4%,W/V):称取4.00g台盼蓝,加少量水研磨,用水溶解后定容至100mL,用定性 滤纸过滤,4℃存放。使用时,用PBS溶液稀释至0.4%。根据需要可直接购买商业化商品。 5.1.2.3仪器设备 自动细胞计数仪:主要由图像处理系统、图像预处理系统、图像分割和图像计数四部分组成 5.1.2.4分析步骤 启动自动细胞计数仪,设定细胞类型。根据仪器的线性范围和上样体积要求取适量细胞悬液加至 台盼蓝染料中(细胞悬液和台盼蓝染料按照1:1比例混匀),上下吹打,轻轻混匀。取适量样本混合物 加至计数池中,按照仪器操作说明,通过高清图像分析系统,自动分析细胞密度、活率及形态。 注:可使用其他等效染料,如噻唑蓝等 5.1.3电容法 5.1.3.1原理 根据测定时的细胞悬液浓度建立细胞悬液浓度与电容值线性关系,计算出K值。将常数K值输 入在线细胞检测仪检测系统中,得到细胞密度。 5.1.3.2设备 电容法在线细胞检测仪:测量范围,0pF~400pF;精度,0.01pF。 5.1.3.3测定步骤 5.1.3.3.1在线细胞检测仪的电容“0"点校准 接通电源,开机稳定30min,将电极放入空白细胞培养液中,并设置合适的温度、搅拌转速以及 pH,各参数需与细胞培养过程中的参数保持一致,待电容数据稳定后进行电容“O”点校准。 注:具体校准操作依据厂家要求进行相应调整。 5.1.3.3.2细胞密度与在电容值正相关常数"K”确定 3
GB-T 38506-2020 动物细胞培养过程中生化参数的测定方法
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