ICS 65.120 CCS B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 22260—2023 代替GB/T22260—2008 饲料中蛋白质同化激素的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of anabolic steroids in feeds- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2024-03-01实施 2023-08-06发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 22260—2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T22260一2008《饲料中甲基罩丸酮的测定 高效液相色谱串联质谱法》，与 GB/T22260一2008相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下： 增加了检出限（见第1章）； a) 更改了原理（见第4章，2008年版的第3章）： c) 更改了试样的提取和净化（见8.1、8.2,2008年版的7.1、7.2）； (P 更改了液相色谱和质谱参考条件（见8.3.1和8.3.2，2008年版的7.3.1和7.3.2）； e) 更改了液相色谱-串联质谱法定性和定量要求（见8.3.4和8.3.5，2008年版的7.3.3）； f) 更改了试验数据处理（见第9章，2008年版的8.1)； g) 更改了精密度（见第10章，2008年版的第9章）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心、中国农业科学院饲料研究所。 本文件主要起草人：黄土新、王博、谷旭、曹莹、张婧、严凤、商军、吴剑平、贾铭、王杰、李军国、 张文刚、黄家莺。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： -2008年首次发布为GB/T22260—2008； 一本次为第一次修订。 1 GB/T 22260—2023 饲料中蛋白质同化激素的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件描述了饲料中蛋白质同化激素的液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中睾酮、甲 基睾丸酮、勃地龙、美雄酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮、诺龙、丙酸诺龙、司坦唑醇、醋酸美伦孕酮、黄体酮的 测定。 本文件甲基睾丸酮、司坦唑醇、醋酸美伦孕酮的检出限为0.005mg/kg，睾酮、勃地龙、美雄酮、雄烯 二酮、脱氢异雄酮、诺龙、丙酸诺龙、黄体酮的检出限为0.02mg/kg；甲基睾丸酮、司坦唑醇、醋酸美伦孕 酮的定量限为0.01mg/kg，睾酮、勃地龙、美雄酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮、诺龙、丙酸诺龙、黄体酮的定 量限为0.05mg/kg。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195动物饲料试样的制备 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 试样中的蛋白质同化激素用乙提取，经吸附剂净化后，用液相色谱-串联质谱仪检测，内标法 定量。 5 试剂或材料 5.1水:GB/T 6682，一级。 5.2乙：色谱纯。 5.3 甲酸：色谱纯。 5.45 50%乙腈溶液：取50mL乙（5.2），加水稀释至100mL，混匀。 5.5 0.01%甲酸溶液：取100μL甲酸（5.3），加水稀释至1000mL，混勾。 5.6 6标准储备溶液（1mg/mL）：准确称取睾酮、甲基睾丸酮、勃地龙、美雄酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮、诺 龙、丙酸诺龙、司坦唑醇、醋酸美伦孕酮、黄体酮各0.01g（精确至0.00001g），分别置于10mL棕色容 1 GB/T22260—2023 量瓶中，用乙睛（5.2）溶解并定容，混匀。于一18℃以下保存，有效期为6个月。蛋白质同化激素标准 品等具体信息见附录A。 5.7混合标准中间溶液I（10μg/mL）：分别准确移取标准储备溶液（5.6）各100μL于10mL棕色容 量瓶中，用乙睛（5.2）稀释、定容，混匀。于一18℃以下保存，有效期为3个月。 中，用乙（5.2）稀释、定容，混匀。临用现配。 5.9同位素内标储备溶液（1mg/mL）：称取睾酮-Ds、甲基睾丸酮-D3、勃地龙-Ds、美雄酮-D3、雄烯二酮- D、脱氢异雄酮-D2、诺龙-D3、丙酸诺龙-D3、司坦唑醇-D3、醋酸美伦孕酮-D3、黄体酮-D，各0.01g（精确 至0.00001g），分别置于10mL棕色容量瓶中，用乙睛（5.2）溶解并定容，混匀。于一18℃以下保存，有 效期为6个月。同位素内标标准品等具体信息见附录A。 5.10同位素内标混合标准中间溶液I（10μg/mL）：分别准确移取同位素内标储备溶液（5.9）各100μL 于10mL棕色容量瓶中，用乙睛（5.2）稀释、定容，混。于一18℃以下保存，有效期为3个月。 5.11同位素内标混合标准中间溶液Ⅱ（1μg/mL）：准确移取同位素内标混合标准中间溶液I（5.10） 1mL于10mL棕色容量瓶中，用乙睛（5.2）稀释、定容，混匀。临用现配。 5.12混合标准系列溶液：准确移取适量混合标准中间溶液Ⅱ（5.8）于棕色容量瓶中，加人适量同位素 内标混合标准中间溶液Ⅱ（5.11），用50%乙睛溶液（5.4）稀释、定容，混匀，配制成质量浓度分别为 1.00ng/mL.5.00ng/mL、10.00ng/mL、20.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL混合标准系列溶 液，同位素内标质量浓度均为10ng/mL。临用现配。 5.13微孔滤膜：0.22μm，有机系。 5.14吸附剂：乙二胺-N-丙基硅烷（PSA），粒径40μm，或性能相当者。 6仪器设备 6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。 6.2天平：精度0.00001g和0.001g。 6.3涡旋振荡器：转速不低于1500r/min。 6.4离心机：转速不低于9000r/min。 6.5涡旋混合器。 6.6氮吹仪。 7样品 按GB/T20195制备样品，至少200g，粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛，充分混匀，装入 磨口瓶中，备用。 8试验步骤 8.1提取 平行做两份试验。称取试样1g（精确至0.001g）于50mL离心管中，准确加入100μL同位素内标 混合标准中间溶液Ⅱ（5.11）、20mL乙腈（5.2），涡旋混匀1min，1500r/min涡旋振荡提取20min， 9000r/min离心5min，上清液备用。 2 GB/T22260—2023 8.2 2净化 移取3mL上清液（8.1)于50mL离心管中，加人100mgPSA粉，涡旋1min，9000r/min离心 5min，准确移取2mL上清液于50℃下用氮气吹干，准确加人1mL50%乙溶液（5.4），涡旋混匀，过 膜（5.13），待测。 8.3 测定 8.3.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： 色谱柱：C18柱，长100mm，内径2.1mm，粒径2.6μm，或性能相当者； a) b) 流动相：A相为乙睛（5.2），B相为0.01%甲酸溶液（5.5），梯度洗脱程序见表1； c) 流速：0.3mL/min； (p 柱温：35℃； e) 进样量：10μL。 梯度洗脱程序 时间 A B min % % 0.00 40 60 2.00 40 60 5.00 100 0 6.50 100 0 6.60 40 60 7.50 40 60 8.3.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 离子源模式：电喷雾电离源； b) 扫描方式：正离子； c) 监测方式：多反应监测（MRM）； d) 电离电压：3.0kV； e) 源温度：150℃； f) 鞘气：800L/h； g) 反吹气：50L/h； h) 雾化器温度：500℃。 多反应监测（MRM）离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。 3 GB/T22260—2023 表 2 蛋白质同化激素及其内标多反应监测（MRM）离子对、锥孔电压及碰撞能量参考值 监测离子对 锥孔电压 碰撞能量 被测物名称 m/z v ev 22 289.0>96.9 睾酮 32 24 289.0>108.5 302.9>96.9 26 甲基睾丸酮 32 28 302.9>109.0 286.9>120.9" 22 勃地龙 20 286.9>134.9 14 32 300.9>92.9 美雄酮 20 300.9>120.9* 24 286.9>96.9* 20 雄烯二酮 24 26 286.9>108.9 288.9>212.9 16 脱氢异雄酮 12 288.9>253.0 10 275.0>108.9a 28 诺龙 30 28 275.0>239.0 22 330.9>56.9 丙酸诺龙 26 12 330.9>257.0* 329.0>80.9* 44 司坦唑醇 40 40 329.0>94.9 397.1>294.5 20 醋酸美伦孕酮 25 397.1>337.1 15 314.9>96.9 22 黄体酮 30 314.9>108.9 28 睾酮-D3 30 22 292.2>97.0* 甲基睾丸酮-D 32 28 306.2>97.0* 勃地龙-D。 290.2>121.1* 20 26 美雄酮-D 304.5>286.2* 20 10 雄烯二酮-D 294.2>113.0a 3