ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 42821—2023 贝类包纳米虫病诊断方法 Diagnostic methods for bonamiosis of molluscs 2024-03-01实施 2023-08-06发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 42821—2023 目 次 前言 1 范围 规范性引用文件 2 术语与定义 3 4 缩略语 试剂和材料 5 6 器材和设备 7 临床症状 8 采样 组织印片检查 9 10 组织病理检查· 11 PCR检测 12 荧光PCR检测 13综合判定 附录A（规范性） 组织印片、组织病理检查及DNA提取相关溶液配制 附录B（资料性） 贝类包纳米虫病 10 附录C（资料性）目标扩增序列及引物、探针的位置 13 GB/T42821—2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 推广总站、广州海关。 本文件主要起草人：吴绍强、王彩霞、白昌明、李清、邓艳、冯春燕、王崇明、阴鸿达、袁向芬、许晓琳、 柏建山。 I GB/T42821-—2023 贝类包纳米虫病诊断方法 1范围 本文件给出了贝类包纳米虫病（bonamiosis）诊断的缩略语、试剂和材料、器材和设备，描述了临床 症状、采样、组织印片检查、组织病理检查、PCR检测、荧光PCR检测和综合判定的方法 本文件适用于牡蛎包纳米虫（Bonamiaostreae）和杀蛎包纳米虫（Bonamiaeritiosa）引起的贝类包 纳米虫病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T 6682 2分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB/T19495.2转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语与定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair) Ct：扩增循环数（cyclethreshold) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸混合物（deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction) SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate） Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus） TE:Tris盐酸和EDTA缓冲溶液（EDTATris·HCI) Tris：三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane） 5试剂和材料 本文件中所有化学试剂，除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 1 GB/T 42821—2023 5.1水：符合GB/T6682中规定的一级水。 2丙酮：常温保存。 5.2 5.3 3甲醇：常温保存。 5.4无水乙醇：常温保存。 5.5 生理盐水（0.9%）：常温保存。 5.6 10XPCR缓冲液（无Mg2+）：一20℃保存。 5.7 MgCl²溶液（25mmol/L）：一20℃保存。 5.8 3dNTPs（A、T、G、C四种碱基各2.5mmol/L）：一20℃保存。 5.9 TaqDNA聚合酶（5U/μL）：一20℃保存。 5.10 姬姆萨染液、戴维森氏固定液：按附录A中A.1和A.2配制。 5.11 蛋白酶K（20mg/mL）：按A.3配制。 5.12 10%SDS：按A.4配制。 5.13 乙酸铵（10mol/L）：按A.5配制。 5.14 酚/三氯甲烷/异戊醇混合液：配制比例25：24：1。 5.15 乙醇溶液（75%）：按A.6配制。 5.16 TE缓冲液：按A.7配制。 5.17 1X电泳缓冲液：按A.9配制。 5.18 阳性对照：已知感染包纳米虫的贝类组织样品，一80℃保存。 5.19 阴性对照：已知未感染包纳米虫的贝类组织样品，一80℃保存。 5.20 空白对照：双蒸水。 5.21 引物BonF:5'-CATTTAATTGGTCGGGCCGC-3'(10μmol/L)，-20℃保存。 5.22 引物BonR:5'-CTGATCGTCTTCGATCCCCC-3'(10μmol/L)，一20℃保存。 5.23 引物BonqF:5-GAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAAC-3'（10μmol/L)，一20℃保存。 5.24 引物BonqR:5'-CATAAGTTAGTCTCACCGGAATTAAAG-3'(10μmol/L)，一20℃保存。 5.25 保存。 5.26琼脂糖：电泳级。 5.27 核酸染料：4℃保存。 5.28 6×上样缓冲液：一20℃保存。 5.29 DNA分子质量标准溶液：一20℃保存。 5.30 苏木精染液、伊红染液、返蓝液：按A.10～A.12配制。 5.31 载玻片。 6器材和设备 6.1 组织切片机。 6.2 2显微镜。 6.34℃冰箱。 6.4 420℃冰箱。 6.5 5-80℃冰箱。 6.6匀浆研磨器。 6.7冷冻高速离心机。 6.8 二级生物安全柜。 2 GB/T42821—2023 6.9普通PCR仪。 6.10 荧光PCR仪。 6.11水平电泳仪。 6.12凝胶成像仪。 6.13 水浴锅。 6.14微量移液器。 6.15电子天平。 7临床症状 患病贝类双壳闭合不全，严重时死亡，轻则无明显症状，见附录B。 8采样 8.1采样对象 优先采集2龄及以上濒死的贝类。 8.2 2采样部位 成贝取血淋巴、鳃、心脏，幼贝、稚贝取内脏团。 8.3 3采集数量 临床无症状贝类样品每个批次采集150个以上，临床有症状贝类样品每个批次采集30个以上。进 口贝类样品的采样数量应符合GB/T18088的规定。 8.4保存及运送 取样应加贴标签，标签上清楚标明样品编号、采样时间、采样地点、采样人员和养殖背景，样品应 24h内冷链送达实验室，立即检测或保存于一80℃冰箱待检。 组织印片检查 9 9.1制片、染色与观察 将鳃或心脏组织用吸水纸吸去多余水分后，用镊子将组织在载玻片上轻轻挤压涂片，使其形成薄层 膜，自然晾干，内酮或甲醇固定1min，滴加姬姆萨染液4滴～5滴，染色5min～10min，流水冲洗，晾干 后置于400倍～1000倍显微镜下观察。 9.2 2结果判定 印片组织中发现虫体判为阳性。 虫体呈球形或卵圆形，大小为2μm～5μm。虫体细胞质呈浅蓝色，细胞核呈红色。常见干血细胞 内，感染严重时，血细胞外也可观察到虫体。染色后虫体形态见图B.1和图B.2。 10 组织病理检查 10.1样品固定 用戴维森氏固定液固定样品，固定液与组织块的体积比为（15：1）～（20：1），固定24h～48h。 3 GB/T42821—2023 10.2石蜡切片制备、染色与观察 按A,13的要求采用组织切片机制备石蜡切片，封片后置于400倍～1000倍显微镜下观察。 10.3结果判定 切片组织中发现虫体即判为阳性。 虫体呈球形或卵圆形，大小为2μm～5μm。虫体细胞质呈浅蓝色，细胞核呈红色，常见于血细胞 内，感染严重时，血细胞外也可观察到虫体。染色后虫体形态见图B.3。 11PCR检测 11.1 实验室技术要求 检测实验室的分区要求、质量控制和质量保证应符合GB/T19495.2的规定。 11.2操作步骤 11.2.1DNA提取 11.2.1.1利用电子天平称取30mg~50mg组织样品，置于0℃~4℃的生理盐水（4℃冰箱预冷）中 反复冲洗，滤纸吸干表面水分后置于勾浆研磨器中并加人0℃～4℃（4℃冰箱预冷）的生理盐水，充分 匀浆研磨。提取过程同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。 11.2.1.2加人2.5μL20mg/mL蛋白酶K至终浓度100μg/mL，再加10%SDS至终浓度为1%（质 量分数），上下颠倒混勾后置于50℃水浴锅中水浴3h，不时旋动。 5min，置于冷冻高速离心机中，12000r/min离心5min。 11.2.1.4吸取上层水相转移至新的1.5mL灭菌离心管中，加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻 轻震荡混匀5min，置于冷冻高速离心机中，12000r/min离心5min。 11.2.1.5吸取上层水相转移至新的1.5mL灭菌离心管中，加入100uL10mol/L乙酸铵，混匀后，再 11.2.1.6采用冷冻高速离心机12000r/min离心10min，沉淀DNA，倾去上清液。 5min，倾去上清液，室温晾干。 11.2.1.8向DNA沉淀中加TE缓冲液100μL溶解，一20℃冰箱保存备用。 11.2.2反应体系 在二级生物安全柜中用微量移液器向PCR管内加入10XPCR缓冲液（无Mg+）2.5μL、MgCl2溶 液(25mmol/L)2.0μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL、10μmol/L引物BonF和引物BonR各 1.0μL、dNTPs（各2.5mmol/L)2.0μL，加人模板DNA2.0μL，补充双蒸水至25