ICS 65.120 CCS B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T42956—2023 饲料中泰乐菌素、泰万菌素、替米考星的 测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of tylosin, tylvalosin and tilmicosin in feeds- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2024-03-01实施 2023-08-06发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T42956—2023 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本文件起草单位：四川省饲料工作总站、四川省中安检测有限公司、新疆维吾尔自治区兽药饲料监 察所。 本文件主要起草人：程传民、李云、许艳丽、王宇萍、达列亚、冯波、蒋福霖、程大顺、赵立军、张静、 柏雪、宋彦琪、叶绿、樊淑娜、邝婷婷、徐定慧、陈飞、何利梅、夏子晴。 GB/T 42956—2023 饲料中泰乐菌素、泰万菌素、替米考星的 测定液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件描述了饲料中泰乐菌素、泰万菌素和替米考星的液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中泰乐菌素、泰万菌素和替米 考星的测定。 本文件的方法检出限为0.02mg/kg，定量限为0.05mg/kg。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195动物饲料试样的制备 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 试样中的待测物用乙睛溶液提取，经混合型阳离子交换柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法 定量。 5试剂或材料 C 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1水:GB/T6682，一级。 5.2乙：色谱纯。 5.3甲酸：色谱纯。 5.450%乙腈溶液：取500mL乙睛，加水稀释至1000mL，混匀。 5.50.1%甲酸溶液：取1mL甲酸（5.3），加水稀释至1000mL，混匀。 5.6磷酸二氢钾溶液（0.1mol/L）：称取磷酸二氢钾13.61g，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。 5.75%氨化甲醇：取氨水5mL，加甲醇稀释至100mL，混匀。 5.8标准贮备溶液（1mg/mL）：称取泰乐菌素A（CAS号：1401-69-0，含量≥98.0%）、泰万菌素 （精确至0.01mg），用甲醇溶解，分别转移至10mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀。一18℃以下保存，有 1 GB/T42956—2023 效期3个月。 注：如所用标准品为相应的盐，折算成有效成分。 醇稀释、定容，混匀。一18℃以下保存，有效期3个月。 至0.01mg），用甲醇溶解，转移至10mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀。一18℃以下保存，有效期 3个月。 5.11内标工作溶液（5μg/mL）：准确移取1mL内标贮备溶液（5.10）于100mL容量瓶中，用甲醇溶解 并定容，混匀。一18℃以下保存，有效期3个月。 5.12混合标准系列溶液：准确移取适量混合标准中间溶液（5.9）和内标工作溶液（5.11)于容量瓶中，用 5%氨化甲醇（5.7）稀释定容，配制成质量浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、 50ng/mL、100ng/mL和内标质量浓度均为5ng/mL的混合标准系列溶液。临用现配。 5.13混合型阳离子交换固相萃取柱：60mg/3mL，或性能相当者。 5.14微孔滤膜：0.22μm，有机系。 6仪器设备 6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。 6.2分析天平：精度为0.1mg和0.01mg 6.3旋涡混合器。 6.4振荡器。 6.5离心机：转速不低于7000r/min。 6.6固相萃取装置。 7样品 按GB/T20195制备试样。取样品至少200g，粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛，充分混 匀，装入密闭容器中，备用。 8试验步骤 8.1提取 平行做两份试验。称取试样2g（精确至0.1mg）于50mL离心管中，准确加入内标工作溶液 (5.11)100μL、50%乙睛溶液（5.4）10mL，300r/min振荡提取15min，7000r/min离心5min，移取上 清液至另一50mL离心管。残渣用50%乙睛溶液（5.4）10mL重复提取一次，合并两次上清液，混匀。 准确移取混合上清液1mL，加人磷酸二氢钾溶液（5.6）5mL，混匀，备用。 8.2净化 混合型阳离子交换固相萃取柱（5.13）依次用甲醇3mL、水3mL和磷酸二氢钾溶液（5.6）3mL活 化。取全部备用液（8.1）过柱，流速小于2mL/min。依次用磷酸二氢钾溶液（5.6）和水各3mL淋洗，抽 干。准确移取5%氨化甲醇（5.7）5mL洗脱，收集洗脱液，混匀，用微孔滤膜（5.14）过滤，作为试样溶液， 待测。 2 GB/T42956—2023 8.3 测定 8.3.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： a) 色谱柱：C色谱柱，柱长50mm，内径2.1mm，粒径1.8um，或性能相当者； b) 柱温：35℃； c) 进样量：5L； (p 流动相：A相为乙睛，B相为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序见表1。 表 1 梯度洗脱程序 时间 流速 A B min mL/min % % 0.0 0.3 10 90 4.0 0.3 90 10 4.1 0.5 100 0 6.0 0.5 100 0 6.1 0.3 10 06 8.0 0.3 10 06 8.3.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+）； b) 检测方式：多反应监测（MRM）； c) 毛细管电压：3.5kV； (p 离子源温度：350℃； 干燥气流速：7L/min； e) f) 雾化气压力：35psi(241kPa)； g) 化合物多反应监测（MRM)离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。 表 2 化合物多反应监测（MRM）离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值 监测离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量 化合物名称 m/2 m/e V ev 916.5>772.5 32 泰乐菌素A 916.5>174.2 252 916.5>174.2 40 1042.5>814.4 32 泰万菌素 1042.5>174.1 280 1042.5>174.1 44 869.5>696.3 42 替米考星 869.5>174.2 232 869.5>174.2 50 替米考星-ds 872.6>696.5 872.6>696.5 232 40 3 GB/T42956—2023 8.3.3混合标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液（5.12）和试样溶液（8.2）上机测定。多反应监测 (MRM)色谱图见附录A。 8.3.4定性 在相同试验条件下，试样溶液中待测物的保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中待测物的保留 时间一致，其相对偏差在土2.5%之内。根据表2选择的定性离子对，比较试样谱图中待测物监测离子 对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的监测离子对的相对离子丰度，若最大允许偏差 不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。 表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 ≤10 最大允许偏差/% ±20 ±25 ±30 ±50 8.3.5定量 按照8.3.1和8.3.2设定仪器条件，取试样溶液和混合标准系列溶液上机分析，以标准溶液浓度为 横坐标，以待测物与内标的色谱峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线，作单点或多点校准。试样溶液与 标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应重新试验。单点校准定 量时，试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。 9 试验数据处理 试样中泰乐菌素A、泰万菌素和替米考星的含量以质量分数w：计，数值以毫克每千克（mg/kg）表 示。多点校准按公式（1)计算，单点校准按公式（2)计算： p, XVxV, =1m (1) 式中： 由标准曲线查得试样溶液中待测物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V 试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）； 固相萃取时洗脱液的体积，单位为毫升（mL）； 上机测定的试样溶液超出线性范围后，进一步稀释的倍数； n Vi 净化时所用试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）； 试样的质量，单位为克（g）。 m A XAisXCXCi XVXV ..(2) AXA.XCi.XV.XmX1000 式中： A, 试样溶液中待测物的峰面积； A'is 标准溶液中内标的峰面积； Cs 标准溶液中待测物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； Crs 试样溶液中内标的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V 试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）； 4 GB/T42956—2023 V2 固相萃取时洗脱液的体积，单位为毫升（mL）； n 上机测定的试样溶液超出线性范围后，进一步稀释的倍数； Ais 试样溶液中内标的峰面积； A. 标准溶液中待测物的峰面积； C'is 标准溶液中内标的质量